HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地山藥飲片中尿囊素和腺苷的含量*

★ 鄭琴 胡鵬翼 龔瑩瑩 伍振峰 岳鵬飛 楊明*

（江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330004）

山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb.的干燥根莖。具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的功能，主治脾虛食少、久瀉不止、肺虛喘咳、腎虛遺精、帶下、尿頻、虛熱、消渴等癥[1]，是中藥常用藥物之一。據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，山藥富含皂苷、粘液質(zhì)、糖蛋白、甘露聚糖、植酸、尿囊素、山藥素、膽堿、多巴胺、粗纖維、果膠、淀粉酶以及多種微量元素等[2]。2010年版《中國(guó)藥典》一部中收載了性狀、鑒別、檢查和浸出物等項(xiàng)目，但缺少含量測(cè)定項(xiàng)，不足以對(duì)飲片質(zhì)量進(jìn)行全面有效的控制。本文建立了山藥飲片中尿囊素、腺苷的高效液相色譜的含量測(cè)定方法，測(cè)定了不同產(chǎn)地山藥飲片中尿囊素及腺苷的含量，從而為山藥的質(zhì)量研究提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀；ΜV2550紫外分光光度計(jì)（島津）；KQ-E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有公司）；BSA223S sartoris分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BP211D電子天平（美國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)為11501-200202）；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)為110879-200202）；山藥飲片收集于各產(chǎn)地，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院龔千峰教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb．的干燥根莖切制而成。甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20110217）；水為二次蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 尿囊素[3]色譜柱：Pinnacle Amina C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80：20），流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm，進(jìn)樣量20 μL，理論板數(shù)按尿囊素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。對(duì)照品及樣品HPLC見(jiàn)圖1。

2.1.2 腺苷[4]Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）［取0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液68.5 mL與0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液31.5 mL混合］-甲醇（85：15）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20 μL；理論板數(shù)按腺苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。對(duì)照品及樣品HPLC見(jiàn)圖1。

圖1 尿囊素、腺苷對(duì)照品及山藥樣品HPLC

2.2 對(duì)照品貯備溶液的制備

精密稱(chēng)取尿囊素對(duì)照品9.20 mg置50 mL容量瓶中，加20%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為184 μg/mL；精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品2.02 mg置25 mL容量瓶中，加15%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為80.8 μg/mL。

2.3 供試品溶液的配制

2.3.1 尿囊素[5]精密稱(chēng)取山藥飲片粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理0.5 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用20%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液用于測(cè)定山藥飲片中尿囊素的含量。

2.3.2 腺苷[6]精密稱(chēng)取山藥飲片粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇10 mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理0.5 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用15%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用于測(cè)定山藥飲片中腺苷的含量。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取尿囊素對(duì)照品貯備溶液0.5、1、1.5、2、3、4 mL至5 mL容量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖；精密吸取腺苷對(duì)照品貯備溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中，15%甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖；并以濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為A=5.5464C-0.5709（r=0.9994），A=69.628C-5.6118（r=0.9991），可見(jiàn)尿囊素在0.368-3.68 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，腺苷在0.01616-0.1616 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定尿囊素、腺苷峰面積值，其RSD分別為1.12%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，分別在0，1，2，4，8，12 h進(jìn)樣6次，測(cè)定尿囊素、腺苷峰面積值，其RSD分別為1.81%、0.98%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品粉末（9號(hào)樣品），按上述供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得尿囊素、腺苷平均含量分別為5.5901 mg/g、0.0636 mg/g，RSD分別為2.03%、1.83%（n=6），表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的山藥樣品粉末6份，精密稱(chēng)定，按高、中、低3種濃度分別加入尿囊素、腺苷對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果尿囊素、腺苷平均加樣回收率為99.93%、99.86%，RSD分別為0.87%、1.12%，見(jiàn)表1、2。

表1 尿囊素加樣回收率

表2 腺苷的加樣回收率（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地山藥樣品粉末各3份，精密稱(chēng)定，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。不同產(chǎn)地山藥藥材中尿囊素、腺苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地山藥藥材中尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

1-9 號(hào)樣品分別購(gòu)自江西南昌不同的藥店；10號(hào)樣品購(gòu)自江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司；其中，1-5號(hào)產(chǎn)地為河南，6、7號(hào)產(chǎn)地為安徽，8、9號(hào)樣品產(chǎn)地為廣西，10號(hào)產(chǎn)地為河南。

3 討論

本文曾采用HPLC法梯度洗脫同時(shí)測(cè)定山藥飲片中尿囊素、腺苷的含量[7，8]，采用 phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0-5 mim，A為99%；5-15 min，A為99%-85%；15-23 min，A為85%）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm；柱溫為30℃，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果，在該條件下尿囊素及腺苷與其他峰均能較好的分離，但樣品中尿囊素、腺苷的含量差異較大，在建立方法學(xué)時(shí)難以兼顧，因此本文將山藥飲片采用不同方法處理，檢測(cè)尿囊素、腺苷的含量。

尿囊素極性很大，在反相色譜柱上保留時(shí)間很短，試驗(yàn)過(guò)程中用普通ODS C18色譜柱，采用了多種液相條件，結(jié)果尿囊素的保留時(shí)間短，分離度不好，因此改用了氨基柱，流動(dòng)相：甲醇-水（80：20），流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)224nm，在該條件下山藥中尿囊素峰形較好，與其他雜質(zhì)峰分離較好。尿囊素?zé)岱€(wěn)定性較差，本文采用超聲提取以確保樣品穩(wěn)定。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]對(duì)比40%甲醇、20%甲醇、40%乙醇、20%乙醇超聲提取，結(jié)果以20%甲醇水溶液提取完全且峰形良好，并確定提取時(shí)間為30 min。

依次選用水、15%、50%，80%，95%乙醇為提取溶劑超聲提取山藥飲片中的腺苷，結(jié)果用15%乙醇提取效果最佳，高濃度的醇提取的腺苷峰型較差，故選定15%乙醇為提取溶劑。對(duì)超聲、加熱回流提取方法進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)用二者差異不大，因此選擇提取方法簡(jiǎn)便的超聲法用于山藥飲片中腺苷的處理方法。

2010年版《中國(guó)藥典》一部中收載了性狀、鑒別、檢查和浸出物等項(xiàng)目，但缺少含量測(cè)定項(xiàng)，不足以對(duì)飲片質(zhì)量進(jìn)行全面有效的控制。目前對(duì)其化學(xué)成分的研究主要集中在多糖和尿囊素類(lèi)成分，對(duì)其他成分的研究則相對(duì)較少，山藥的質(zhì)量控制模式還有待進(jìn)一步優(yōu)化[10]。腺苷為山藥中的有效成分之一，可以作為山藥以及山藥相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分。本文建立的HPLC方法測(cè)定山藥飲片中尿囊素和腺苷的含量，該法精密度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，為山藥飲片的全面質(zhì)量控制提供了參考。

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