鄧艷美,丁誠(chéng)實(shí),劉輝輝

(棗莊學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160)

海藻酸鈉包埋肝素鈉及其緩釋效果

鄧艷美,丁誠(chéng)實(shí),劉輝輝

(棗莊學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160)

選取最佳的海藻酸鈉包埋濃度，并對(duì)肝素鈉在海藻酸鈉顆粒中的釋放效果進(jìn)行研究. 采用的是可見分光光度法測(cè)定肝素鈉的含量，以此測(cè)得肝素鈉的包封率及其緩釋效果.海藻酸鈉包埋的最佳濃度是5mg/L，肝素鈉的包封率是86%，海藻酸鈉包埋的顆粒對(duì)抗凝血時(shí)間延長(zhǎng)了一半.

海藻酸鈉；肝素鈉；包埋；緩釋①

0 引言

肝素鈉是一種含有硫酸基團(tuán)的粘多糖，屬于陰離子化合物.肝素鈉作為抗凝藥物，主要是加強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的作用，ATⅢ與凝血酶相結(jié)合，形成 ATⅢ凝血酶復(fù)合物而使凝血酶失活，從而阻止凝血酶的形成并有阻止血小板聚集等抗凝作用[1].

包埋法是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種新興細(xì)胞固定化技術(shù)[2],它具有許多優(yōu)點(diǎn)：(1)它操作簡(jiǎn)單,無(wú)需太多繁雜的步驟；(2)包埋好后對(duì)包埋的物質(zhì)結(jié)構(gòu)或是細(xì)胞活性影響較??；(3)效率高，其包封率一般都能達(dá)到60%以上.因此是目前細(xì)胞固定化研究和應(yīng)用最廣泛的方一種法[3].海藻酸鈉是從褐藻中提取出來(lái)的,由海藻酸鈉制備的微球顆粒,具有許多優(yōu)良的特點(diǎn)，如生物黏附性、生物相容性,并且無(wú)毒副作用,尤其是當(dāng)海藻酸鈉溶液滴入鈣離子溶液時(shí),很容易就形成微球顆粒,并且該過(guò)程十分柔和.海藻酸鈉的這種良好的成球特性,能夠使其適合包埋藥物、蛋白質(zhì)與細(xì)胞等物質(zhì),因此常被用作控釋載體，并被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域[4-7].

肝素鈉含量的測(cè)定常采用的是生物學(xué)方法[8]、化學(xué)方法有分光光度法[9]、HPLC法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、電化學(xué)傳感器[12]等方法.

本試驗(yàn)采用的是可見分光光度法.在特定的波長(zhǎng)下得到某一吸光度值.但對(duì)較高濃度的肝素鈉測(cè)定有局限性，必須稀釋到低濃度下才可以進(jìn)行測(cè)定.

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

肝素鈉 (Regal Biotechnology Company)，兔全血，氯化鈉，無(wú)水乙醇，氯化鈣.

1.2 儀器

TM-1000掃描電鏡(日本日立公司)；臺(tái)式倒置熒光顯微鏡(深圳市叁諾西努科技有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(杭州惠爾儀器設(shè)備有限公司)；電子天平JT201N(上海精天儀器有限公司)；KDM型控溫電熱套(山東鄄城華魯儀器公司)；MYB型調(diào)溫電熱套(華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)等.

2 試驗(yàn)方法

2.1 海藻酸鈉包埋肝素鈉顆粒的制備

2.1.1 肝素鈉溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

購(gòu)置的肝素鈉為粉末狀態(tài)，效價(jià)是≥170IU/mg.用生理鹽水分別配置成0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1.0mg/ml的溶液，避光保存.五種溶液分別標(biāo)記為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ.其對(duì)應(yīng)的效價(jià)分別為34IU/ml，68IU/ml，102IU/ml，136IU/ml，170IU/ml.

本試驗(yàn)采用了紫外可見分光光度法測(cè)肝素鈉含量，在430 nm處分別對(duì)上述五種濃度的肝素鈉溶液測(cè)吸光度值[15].繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.

2.1.2 海藻酸鈉濃度對(duì)顆粒的影響

分別稱取0.0625mg，0.125mg，0.1875mg，0.25mg，0.375mg海藻酸鈉于燒杯中，加入25ml去離子水，在電熱套中加熱融化直至溶液較為均勻，配制成濃度分別為2.5mg/L，5.0mg/L，7.5mg/L，10.0mg/L，15.0mg/L的溶液.并從低濃度到高濃度依次標(biāo)號(hào)為1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)，4號(hào)，5號(hào).用5ml醫(yī)用針管吸取海藻酸鈉溶液并滴入到CaCl2溶液中，放置半小時(shí)左右.

2.1.3 顆粒的包埋及包封率的測(cè)定

取1.0ml濃度為0.2mg/ml的肝素鈉溶液加入到0.1ml的3% CaCl2溶液中，混勻待用.用5mL醫(yī)用注射器吸取已配置好的5mg/L的海藻酸鈉溶液，一滴一滴的慢速注入到上述混勻的溶液中，靜置半小時(shí)左右，以便形成圓形顆粒.將顆粒取出放在倒置顯微鏡及掃描電鏡下觀察，測(cè)量總長(zhǎng)度，并求得其平均直徑.

包封率公式計(jì)算為：M包/M總×100%，M包是包埋在海藻酸鈉顆粒里面的肝素鈉含量，M總是未包埋之前肝素鈉的總含量.

2.2顆粒的初步緩釋效果

2.2.1海藻酸鈉肝素鈉顆粒釋放程度的測(cè)定

取同樣肝素鈉濃度的顆粒，將顆粒放在生理鹽水中，再置于37℃恒溫水浴箱中，使其進(jìn)行肝素鈉樣品的釋放，每隔2小時(shí)取溶液進(jìn)行紫外可見分光光度測(cè)定.

2.2.2海藻酸鈉肝素鈉顆粒在兔血中的初步緩釋效果

將包埋好的顆粒用蒸餾水沖洗2遍并自然晾干.準(zhǔn)備10支1.5 ml的EP管，5種濃度的包埋好的顆粒，將包埋好的顆粒分別放入5支EP管中，加入少量的生理鹽水使其均勻的懸浮在EP管中；另外5支EP管分別加入0.5mL的肝素鈉溶液.

對(duì)兔子心臟部位的皮膚進(jìn)行消毒，用一次性醫(yī)用針管從兔子的心臟中采集新鮮的血液，并將采集的新鮮血液立即注入到10支1.5mL的EP管中，每管含量約為1ml.對(duì)EP管進(jìn)行搖晃使顆粒在EP管中盡量分布均勻.將EP管放入到37℃恒溫水浴箱中，計(jì)時(shí)并且每隔15min慢慢傾斜EP管，觀察血液還是否流動(dòng)，直到凝固為止，記錄血液凝固時(shí)間.

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 不同濃度海藻酸鈉對(duì)顆粒的影響及肝素鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

據(jù)五種濃度的肝素鈉繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：y=-0.1895x+1.3329,R2=0.9991.

圖1 肝素鈉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2至圖6為五種不同濃度的海藻酸鈉形成的顆粒，顆粒形成時(shí)未加入肝素鈉樣品.

圖 2 1號(hào)濃度海藻酸鈉 圖3 2號(hào)濃度的海藻酸鈉

圖4 3號(hào)濃度的海藻酸鈉 圖5 4號(hào)濃度的海藻酸鈉

圖 6 5號(hào)濃度的海藻酸鈉

表1為不同濃度的海藻酸鈉顆粒描述，表中將從顆粒的圓滑度，有無(wú)拖尾現(xiàn)象及硬度來(lái)對(duì)包埋好的顆粒進(jìn)行描述.

表1 不同濃度的海藻酸鈉顆粒描述

從圖3可知2號(hào)濃度的海藻酸鈉形成的顆粒比較圓并且形成的粒徑比較均一，拖尾現(xiàn)象幾乎沒(méi)有.所以采用2號(hào)濃度的海藻酸鈉包埋肝素鈉即5 mg/L濃度的海藻酸鈉.

3.2 包埋好的海藻酸鈉肝素鈉顆粒結(jié)果

肉眼觀察已經(jīng)包埋好的海藻酸鈉肝素鈉顆粒，顆粒圖片見圖7.

圖7 包埋好的海藻酸鈉肝素鈉顆粒

圖7顯示了包埋好的海藻酸鈉肝素鈉顆粒，其顆粒形態(tài)比較均一，幾乎無(wú)拖尾現(xiàn)象.初步包埋比較成功.

將包埋好的顆粒取出后，對(duì)剩余的溶液進(jìn)行紫外可見分光光度測(cè)定.其吸光度值為1.3276，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式算得肝素鈉的含量為0.028mg.所以包封率為86%.

包埋好的海藻酸鈉肝素鈉顆粒放在倒置熒光顯微鏡下觀察.顆粒圖片見圖8.

圖8 倒置顯微鏡下包埋顆粒情況 40×

圖 8(a)和圖 8(b)是從不同的角度觀察顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu).從圖 8中可以看到包埋的顆粒不是標(biāo)準(zhǔn)的圓，圖中的顯示的顆粒透明度不均一，這可能是因?yàn)轭w粒有空隙或是光度太強(qiáng)使得透明度加大了.

為了更好的觀察顆粒的表面狀況，對(duì)包埋好的海藻酸鈉肝素鈉顆粒進(jìn)行掃描電子顯微鏡的觀察并求得其平均直徑為0.42mm.見圖 9.

圖9 包埋顆粒在掃描電鏡下的情況

圖 9(a),圖 9(b),圖 9(c)分別是在40×，120×，300×下的照片.由圖 9(b)顯示顆粒的表面凹凸不平，而且還有縫隙，這正是被包埋的肝素鈉樣品進(jìn)行釋放到顆粒外面所必需的.同時(shí)，也是肝素鈉進(jìn)行緩釋作用所必需的.

由圖 9(c)的放大倍數(shù)是300×，從圖中計(jì)算顆粒的平均直徑為0.42mm，可以進(jìn)行體外抗凝血試驗(yàn).由于顆粒不是正球體，所以我們求得的直徑是一個(gè)平均數(shù).

3.3 海藻酸鈉肝素鈉顆粒緩釋效果的初步結(jié)果

每隔2小時(shí)取溶液進(jìn)行紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定，得到如表2的結(jié)果.

表2 肝素鈉在海藻酸鈉顆粒中的釋放程度

包埋了肝素鈉的海藻酸鈉顆粒在生理鹽水中進(jìn)行了12h的釋放，釋放時(shí)間一直是持久的.其緩釋效果也比較明顯，預(yù)計(jì)能在血液抗凝方面起到一定的作用.

不同濃度的肝素鈉在包埋時(shí)和未包埋時(shí)抗凝血時(shí)間見表3.

表3 不同濃度肝素鈉包埋顆?？鼓獣r(shí)間

由表3可知，包埋組每一管的抗凝血時(shí)間明顯比未包埋組的抗凝血時(shí)間延長(zhǎng)了許多，延長(zhǎng)時(shí)間能延長(zhǎng)接近未包埋時(shí)抗凝時(shí)間的一半.這也充分證明了海藻酸鈉包埋肝素鈉的可行性并且其緩釋的初步效果還是不錯(cuò)的.被包埋的不同濃度的肝素鈉，它的抗凝時(shí)間也不一樣，隨著肝素鈉濃度的加大，抗凝時(shí)間也延長(zhǎng).表3中列出了一些在不同肝素鈉濃度下的抗凝時(shí)間，這也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一定的臨床參考價(jià)值.

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SodiumAlginateEmbeddingHeparinSodiumandItsReleaseEffect

DENG Yan-mei,DING Cheng-shi,LIU Hui-hui

(Department of life science,zaozhuang university, zaozhuang 277160 ,China)

The best concentration of the Sodium alginate was selected and study on the release effect of Heparin sodium in the Sodium alginate particles. The content of Heparin sodium was determined by Spectro-photometric method. In addition, the encapsulation efficiency of Sodium alginate in the particles and the release effect was tested. He best concentration of Sodium alginate for embedding was 5mg/L; The encapsulation efficiency in particles was calculated at 86%; Sodium alginate particles did play a significant role in delaying blood agglutination and its delaying can be one and a half of the initial effect.

sodium alginate; heparin sodium; embedding; sustained-release

Q539.7

A

1004-7077(2013)05-0118-06

2013-08-15

鄧艷美(1977- )，女，山東棗莊人，棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院講師，碩士研究生，主要從事生物制藥研究.

胡勤忠]