王永威， 沈健增， 蔡宇杰*， 廖祥儒， 李枝玲， 張大兵

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安223001）

色素一個(gè)比較寬泛的術(shù)語(yǔ)，日常生活中習(xí)慣把食用色素稱為色素，在人們的生活中有著重要的作用；它可以改善物品和食品的顏色，是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。色素一般分為天然色素和合成色素[1]。天然色素主要來(lái)源于植物、動(dòng)物和微生物等[2]，植物色素主要來(lái)源于天然植物的根、莖、葉、花、果實(shí)；動(dòng)物色素來(lái)源于動(dòng)物身體及組織器官內(nèi)累積的天然有色顆粒，例如昆蟲、魚類、鳥類及獸類等，有著各式各樣的顏色，包括保護(hù)色和警戒色；動(dòng)植物色素一般對(duì)身體無(wú)害，并且有許多還具有醫(yī)療保健作用[3-4]；合成色素雖然色澤鮮艷、穩(wěn)定性好、著色力強(qiáng)，且易于溶解、調(diào)色、成本低，但是很多化學(xué)合成色素具有毒性和致癌性[5]，因此，很多合成色素被禁用，逐漸被天然色素所取代[1]。隨著人民認(rèn)識(shí)的提高，人們對(duì)食品的安全問(wèn)題關(guān)心的更多，因此，天然色素對(duì)人們未來(lái)的生活將會(huì)起到更大的作用。

但是動(dòng)植物色素的生產(chǎn)受到時(shí)間和空間等許多因素的限制，因此不能滿足日益增加的需求量；可是，用微生物生產(chǎn)色素就不受那么多的因素影響，可以一年四季連續(xù)不斷的發(fā)酵生產(chǎn)，可以滿足日益增加的需求量，并且，微生物色素大部分具有活性和醫(yī)療作用[6]；因此，采用微生物生產(chǎn)天然色素將逐漸成為天然色素來(lái)源的重要渠道[7]；不過(guò)，現(xiàn)在開發(fā)的微生物色素種類非常少，文獻(xiàn)報(bào)道的也不多[8-12]，相對(duì)于動(dòng)植物色素的種類，現(xiàn)在迫切需要開發(fā)新的微生物色素，以滿足社會(huì)的需求。著眼于微生物生產(chǎn)色素的優(yōu)勢(shì)，作者對(duì)鐮刀霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的色素進(jìn)行了提取技術(shù)和分離技術(shù)方面的初步研究，色素的分離方法主要有薄層層析法和色譜法[13-14]，作者用高效液相色譜法取得良好的分離效果，為進(jìn)一步研究鐮刀霉菌色素提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 鐮刀霉菌（Fusarium sp）JN158菌株，作者實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA斜面培養(yǎng)基（g/L）：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，pH 自然；種子培養(yǎng)基（g/L）：土豆 200，葡萄糖 20，pH自然；液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（改造的高氏培養(yǎng)基）（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 1，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀 0.5，硫酸鎂 0.5，硫酸亞鐵 0.01，pH自然。

1.1.3 試劑 蒸餾水，乙酸，三氟乙酸，鹽酸，氫氧化鈉，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，石油醚，乙醚，苯甲醇，甲苯，吡啶，氯仿，二甲亞砜，葡萄糖，氯化鈉，磷酸氫二鉀等均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器 高速冷凍離心機(jī)：HITACHI公司產(chǎn)品；PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)EZ585Q：美國(guó)FTS公司產(chǎn)品；Agilent1200液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；722分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體的發(fā)酵與色素的提取 在超凈臺(tái)內(nèi)，從試管斜面上挑取一塊菌落到含有種子培養(yǎng)基50 mL的250 mL的三角瓶中，放入200 r/min、30℃的搖床中培養(yǎng)48 h，按照6%的接種量接到30 L的氣升式發(fā)酵罐中（裝液量20 L），通氣量為30 L/min，培養(yǎng)80 h。發(fā)酵液冷凍離心機(jī)離心10 min得到藍(lán)色菌體（8 000 r/min，4 ℃），菌體冷凍干燥后，加入 5 倍體積的乙酸溶液浸提5 h，浸提液以8 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，菌體再用乙酸溶液浸提幾次，直至無(wú)色素溶出，合并上清液，真空濃縮至膏狀，依次加10倍體積的乙酸乙酯、丙酮各洗滌3次，以8 000 r/min離心10 min，去除脂類物質(zhì)，取上清液真空濃縮至膏狀，再冷凍干燥得到色素粗品，保藏備用。

1.2.2 提取劑的選取 取干燥菌體16份，每份0.500 g，研缽粉碎后，放入150 mL干凈的燒杯中，再分別加入蒸餾水、pH=12的氫氧化鈉、pH=2的鹽酸、無(wú)水乙醇、pH=2的無(wú)水乙醇、pH=12的無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、甲苯、苯甲醇、二甲亞砜、乙酸、三氟乙酸溶液50 mL到150 mL的燒杯中，用保鮮膜封閉，放到30℃，200 r/min的搖床中浸提，兩天后觀察浸提液顏色。

1.2.3 色素最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取一定量色素溶解于乙酸中，用紫外分光光度計(jì)對(duì)之進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.4 色素溶解性驗(yàn)證 分別準(zhǔn)確稱量色素樣品14份，每份0.100 g，放入20 mL的試管中，分別加入蒸餾水、pH=2的氫氧化鈉、pH=12的鹽酸、無(wú)水乙醇、pH=2的無(wú)水乙醇、pH=12的無(wú)水乙醇、氯仿、pH=2的氯仿、pH=12的氯仿、乙酸乙酯、pH=2的乙酸乙酯、pH=12的乙酸乙酯、乙酸、三氟乙酸15～20 mL的試管中，試管振蕩2 min后靜置30 min，觀察溶液的顏色。

1.2.5 色素的HPLC分離 分離條件：色譜柱，Phecda C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫，25 ℃；DAD 檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)，254 nm；流量，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL。流動(dòng)相A是含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA的乙腈，流動(dòng)相B是含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA（氟乙酸）的蒸餾水，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度程序Table 1 Gradient program of mobile phase

2 結(jié)果與討論

2.1 鐮刀霉菌最佳培養(yǎng)時(shí)間的選擇

以改造后的高氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)鐮刀霉菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，每日定時(shí)取樣測(cè)定紫色素產(chǎn)量、菌體干質(zhì)量和pH值，結(jié)果如圖1。

在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵效果的優(yōu)劣與培養(yǎng)基組成和菌體自身的生理性狀有關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體生物量會(huì)逐漸增加，但是，菌體繁殖到一定程度后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，菌體逐漸趨于老化，菌體會(huì)自溶。

由圖1可知，菌體培養(yǎng)的第2天，才有紫色素產(chǎn)生，這是因?yàn)?，該色素是菌體的次級(jí)代謝產(chǎn)物；隨著菌體的生長(zhǎng)，紫色素的產(chǎn)量就越來(lái)越多。當(dāng)培養(yǎng)到第4天時(shí)，紫色素的產(chǎn)量達(dá)到最大，之后色素產(chǎn)量開始下降，同時(shí)，菌體的干質(zhì)量濃度也開始下降，這是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)基本上被消耗完，菌體開始自溶，菌體內(nèi)的物質(zhì)跑到發(fā)酵液中；色素產(chǎn)量下降，可能是因?yàn)榫w自溶導(dǎo)致色素與許多物質(zhì)（氧氣）發(fā)生相互作用，色素本身結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，由于菌體的快速生長(zhǎng)，使得葡萄糖被利用而產(chǎn)酸，所以發(fā)酵液的pH值略呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖1 鐮刀霉菌JN158生長(zhǎng)曲線與色素的產(chǎn)量曲線Fig.1 Growth curve ofFusarium sp.JN158 and production curve of pigment

2.2 色素最佳提取時(shí)間的選擇

在100 mL的燒杯中，用50 mL乙酸在200 r/min條件下浸提每克干燥菌體，每2 h測(cè)量吸光值，吸光度隨浸提時(shí)間的變化如圖2。

圖2 吸光度隨浸提時(shí)間的變化曲線Fig.2 Absorbance curve with the extraction time

從圖中可知，吸光度隨著浸提時(shí)間的增加而增大，當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)10 h時(shí)，吸光度變化不大，也就是色素達(dá)到了溶解平衡，因此，以后選擇12 h為浸提時(shí)間。

2.3 pH對(duì)鐮刀霉菌素色澤變化的影響

鐮刀霉菌色素，在酸性介質(zhì)中呈深紫紅至紫紅色，并隨pH的增大，亮度增加，在酸性pH值范圍，色澤具有相對(duì)的穩(wěn)定性，在堿性條件下，鐮刀霉菌色素形成藍(lán)色沉淀，這與有的色素會(huì)隨著pH的變化而顏色也隨之變化不同[13]，這說(shuō)明，酸堿對(duì)色素的結(jié)構(gòu)變化起到很大的作用，但是，在酸性條件下，色素的結(jié)構(gòu)不會(huì)隨著酸性強(qiáng)度的改變而發(fā)生很大的變化。

2.4 色素提取劑的選取和溶解性驗(yàn)證

30℃條件下，溶劑浸提兩天后試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑的提取結(jié)果Tab.2 Extraction results of different solvents

由表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙酸、三氟乙酸和pH=1的無(wú)水乙醇對(duì)色素有一定的提取能力，其余的溶劑都沒(méi)有。這表明，該色素的溶解性很獨(dú)特，因?yàn)?，?guó)內(nèi)文獻(xiàn)上報(bào)道的色素提取劑一般就是蒸餾水，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，醚類等，而在本實(shí)驗(yàn)中這些溶劑都不能從菌體中提取到色素，足見該色素溶解的獨(dú)特性。因?yàn)橐宜岜纫掖純r(jià)格便宜，三氟乙酸具有毒性，因此，作者選乙酸作為提取劑。

色素溶解性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，色素可以溶解于酸性的有機(jī)溶劑或有機(jī)酸，不能溶解于其余的溶劑。這表明，影響色素溶解效果的因素主要有兩個(gè)，第一個(gè)，溶液必須是有機(jī)溶劑；第二，有機(jī)溶劑必須是酸性。很可能是因?yàn)樗嵝愿淖兞松氐目臻g結(jié)構(gòu)，使之能溶解在有機(jī)溶劑中，而堿性環(huán)境使色素結(jié)構(gòu)又發(fā)生變化，變成原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)?？梢杂眠@個(gè)特點(diǎn)，對(duì)色素進(jìn)行多次萃取。

表3 不同溶劑的溶解結(jié)果Table 3 Dissolution results of different solvent

2.5 色素的最大吸收波長(zhǎng)

經(jīng)全波長(zhǎng)掃描得到色素的最大吸收波長(zhǎng)是510nm。

圖3 紫色素可見光吸收光譜Fig.3 Absorption spectrum of purple pigment in visible light wavelength

2.6 色素的HPLC分離

2.6.1 洗脫程序的選擇 通過(guò)多次試驗(yàn)，找到色素分離的最佳梯度洗脫程序（見表1）；其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TFA的體積分?jǐn)?shù)45%乙腈作為流動(dòng)相的色素分離圖譜見圖4，用最佳洗脫程序分離得到的分離圖譜見圖5。

圖4 乙腈為流動(dòng)相的色素分離圖譜Fig.4 Chromatogram mapofpigmentwith45%acetonitrile as mobile phase

圖5 最佳梯度程序的色素分離圖譜Fig.5 Chromatogram map of pigment with the best gradient elution program

比較兩張圖譜，可知：?jiǎn)我挥皿w積分?jǐn)?shù)0.1%TFA的體積分?jǐn)?shù)45%乙腈作為流動(dòng)相不能把極性物質(zhì)與弱極性的色素成分分開，這是因?yàn)椋?5%的乙腈洗脫能力太強(qiáng)，導(dǎo)致極性成分與色素一起被沖出；可是，梯度洗脫程序中，開始3 min內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)2%～6%的乙腈先把極性成分沖出來(lái)，也就是圖4中前6 min的成分，圖3中前5 min的成分，而這樣的洗脫強(qiáng)度不會(huì)對(duì)色素的吸附產(chǎn)生多大的影響，然后，直接適當(dāng)加強(qiáng)洗脫強(qiáng)度，這樣弱極性的成分就可以分開，實(shí)現(xiàn)了極性成分與弱極性成分的分離，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)的弱極性成分之間的分離。

2.6.2 流動(dòng)相的選擇 把梯度洗脫程序中的乙腈換成甲醇分離色素得到的圖譜見圖5。

比較圖5和圖6可知：兩者都實(shí)現(xiàn)了極性成分與弱極性成分的分離，但是，用甲醇作為流動(dòng)相沒(méi)有實(shí)現(xiàn)色素成分較好的分離，這個(gè)與流動(dòng)相和色素成分之間的相互作用有很大的關(guān)系，不同的流動(dòng)相適合不同成分的分離，所以，選擇乙腈作為分離色素的流動(dòng)相。

圖6 甲醇為流動(dòng)相的色素分離圖譜Fig.6 Chromatogram map of pigment with methanol as mobile phase

2.6.3 色素成分的分析 圖5中，使用的是DAD檢測(cè)器，得到以下色素成分信息（表5、圖7、圖8）。

表5 色素成分信息Table 5 Information of pigment from Fig.4

圖7 16.792 min色素的吸收?qǐng)D譜Fig.7 Absorption spectrum of the pigment of 16.792 minute in 200～700 nm

圖8 23.220 min色素的吸收?qǐng)D譜Fig.8 Absorption spectrum of the pigment of 23.220 minute in 200～700 nm

表5可知：該鐮刀霉菌色素共有8種成分，其中，4種紅色，3種橙色，1種黃色；其中23.220 min的色素成分將近占到色素總量的一半，11.792 min的色素含量次之，12.107 min和14.205 min的色素含量相近，33.048 min和34.733 min的色素含量相近；11.129 min、23.220 min、34.733 min 的色素成分在508 nm附近有最大吸收峰，說(shuō)明這幾個(gè)色素成分 很 可 能 有 共 同 的 結(jié) 構(gòu) ，12.107、14.205、27.579、33.048 min的色素成分在456 nm附近有最大吸收峰，說(shuō)明這幾個(gè)色素成分很可能有共同的結(jié)構(gòu)，16.792 min的色素成分在498 nm有最大吸收峰；一般黃酮類物質(zhì)在255 nm和355 nm附近有最大吸收峰，但是，這8種色素成分在355nm附近沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明，該色素不是黃酮類物質(zhì)[14-15]。

3 結(jié)語(yǔ)

研究了鐮刀霉菌（Fusarium sp）JN158色素的提取條件、溶解特性和液相分離方法，選用乙酸作為提取劑，選擇4 d作為發(fā)酵時(shí)間，選擇12 h作為浸提時(shí)間；該色素只能在酸性的有機(jī)溶劑或有機(jī)酸中溶解；色素在酸性條件下為紅色，色素的顏色隨著pH的改變不會(huì)發(fā)生顏色的很大變化；用高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了色素的良好分離，選擇乙腈作為流動(dòng)相，找到了較好的梯度洗脫程序，分離得到8種色素成分及自的吸收波長(zhǎng)，其中，4種紅色，3種橙色，1種黃色，且該色素屬于黃酮類物質(zhì)。

從色素的溶解性可知，該色素的性質(zhì)非常特殊，有文獻(xiàn)報(bào)道，有的色素在堿性條件下能溶解而在酸性條件沉淀[18]，而該色素的溶解性與之相反，也沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道這樣溶解性的色素，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)應(yīng)該很特殊，該色素的結(jié)構(gòu)正在研究中。

[1]陳運(yùn)中.天然色素的生產(chǎn)及應(yīng)用[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007.

[2]鄧祥元，王淑軍，李富超，等.天然色素的資源和應(yīng)用[J].中國(guó)調(diào)味品，2006，10（10）：49－53.DENG Xiang-yuan，WANG Shu-jun，LI Fu-chao，et a1.Resources and application of natural pigments[J].China Condiment，2006，10（10）：49－53.（in China）

[3]王薇.食用天然色素的營(yíng)養(yǎng)保健作用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005，1（1）：45－47.WANG Wei.The nutrition health effects of natural pigment[J].Food and Nutrition in China，2005，1（1）：45－47.（in Chinese）

[4]張慶杰，丁霄霖.番茄紅素的保健作用與開發(fā)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1997，23（4）：72－75.ZHANG Qing-jie，DING Xiao-lin.Lycopene role in health care and development[J].Food and Fermentation Industries，1997，23（4）：72－75.（in Chinese）

[5]Sava V M，Yang S M，Hong M Y，et al.Isolation and characterization of melanic pigments derived from tea and tea polyphenols[J].Food Chemistry，2001，73（2）：177－184.

[6]Butler M J，Day A W.Fungal melanins：a review.Can J Microbial，1998，44（9）：1115-1136.

[7]王君，張寶善.微生物生產(chǎn)天然色素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（3）：580－583.WANG Jun，ZHANG Bao-shan.Research progress on natural pigments produced by microorganisms[J].Microbiology，2007，34（3）：580－583.（in China）

[8]Leonid V B，Jan K H，Wim K.5-hydroxyaloesaponarin aminorblue pigment in an actinorhodin negative mutant of Streptomyces coelicolorA3（2）[J].J Biotechnol ApplBiochem，1997，26：195－201.

[9]Abbas A，Edwards C.Effect of metals on Streptomyces coelicolor growth and actinorhodin production[J].J Appl Environ Microbial，1990，56：675－680.

[10]Lu L，Cui H L，Chen Y N.Isolation and identification of Streptomyces sp.and assay of its exocellular water-soluble blue pigments[J].J Folia Microbial（Praha），2002，47（5）：493-498.

[11]盧艷杰，陳正行，姚惠源.玉米蛋白粉中黃體素和玉米黃素的分離與定性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，22（5）：11－14.LU Yang-jie，CHEN Zheng-xing，YAO Hui-yuan.Separation and characterization of lutein and zeaxanthin in corn gluten meal[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2003，22（5）：11－14.（in Chinese）

[12]趙慶喜，薛長(zhǎng)湖，徐杰，等.反相高效液相色譜-柱后衍生法分析檢測(cè)魷魚中的生物胺[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26（3）：15－18.ZHAO Qing-xi，XUE Chang-hu，XU Jie，et al.Determination of biogenic amines in squid by reversed phase high-performance liquid chromatography and post-column derivatization[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2007，26（3）：15－18.（in Chinese）

[13]寇嫻，張雁冰，趙清治，等.竹黃中紅色素的提取與鑒定[J].河南藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34（2）：80－81.KOU Xian，ZHANG Yan-bing，ZHAO Qing-zhi，et al.The Extraction and identification of red pigment from Shiraia[J].Journal of Henan Pharmaceutical University，1999，34（2）：80－81.（in Chinese）

[14]Teris A vanBeek.Chemical all alysis of Ginkgo biloba leaves and extracts[J].Journal of chromatography A，2002，967：2l－55.

[15]凌云，何板作，鮑燕燕，等.浮萍的化學(xué)成分研究[J].中草藥，1999，30（2）：88-89.LING Yun，HE Ban-zuo，BAO Yan-yan，et al.The study of chemical composition on duckweed[J].Journal of Chinese Herbal Medicine，1999，30（2）：88－89.（in Chinese）

[16]王學(xué)增，王景晨，王亞蕾，等.堿溶酸沉淀法提取黑米天然色素的研究[J].信陽(yáng)師院學(xué)報(bào)，1995，7（4）：392－395.WANG Xue-zeng，WANG Jing-chen，WANG Ya-bei，et al.Alkali solution and acid precipitation method to extract natural pigment of black rice[J].Journal of Xinyang Teachers College，1995，7（4）：392－295.（in Chinese）