魏言春，宋佳興

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所、暨激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

許多小分子藥物可以高親和性地與血漿蛋白可逆結(jié)合。這種結(jié)合可以延長藥物分子在血液中的循環(huán)壽命，有利于藥物的輸運(yùn)，同時(shí)也減少了具有藥理活性的游離藥物分子的濃度，起到“緩釋”作用［1，2］。另外，與蛋白質(zhì)結(jié)合對于那些在血漿中溶解度非常低的藥物的輸運(yùn)也尤為重要。但結(jié)合有時(shí)也會(huì)對藥效的發(fā)揮產(chǎn)生不利的影響，甚至導(dǎo)致藥物的變性和失效［3］。因此研究結(jié)合影響藥物功能發(fā)揮的原因，不僅對于揭示體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)問題，指導(dǎo)合理用藥具有一定意義，同時(shí)對于進(jìn)行藥物分子設(shè)計(jì)、開發(fā)新藥，也具有重要的指導(dǎo)意義。

藥物和蛋白的結(jié)合雖然不是特異性的，不像受體配體結(jié)合那樣專一，但蛋白和藥物分子的結(jié)合都發(fā)生在相對穩(wěn)定的結(jié)合部位并伴隨一定程度的構(gòu)象變化［4，5］。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，是最為重要的藥物結(jié)合蛋白。HSA分子包括三個(gè)結(jié)構(gòu)上相似的功能域(domainⅠ，Ⅱ，Ⅲ)，每個(gè)功能域又包含兩個(gè)相似的螺旋結(jié)構(gòu)的亞域(subdomainA和subdomainB)，六個(gè)亞域聚集在一起，形成了一個(gè)不對稱的心型分子［6，7］。研究表明藥物在HSA上的結(jié)合部位有三個(gè)包括Ⅰ:吲哚及苯二氮卓結(jié)合部位;Ⅱ:華法令及阿扎丙宗結(jié)合部位;Ⅲ:洋地黃毒甙結(jié)合部位。

1992年，Carter在報(bào)道HSA的高分辨晶體結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也報(bào)道了幾種配體與 HSA結(jié)合的情況［8］。他們指出HSA上的亞域ⅡA和ⅢA上的疏水腔是其主要的配體結(jié)合部位。HSA能夠和許多藥物結(jié)合，研究表明有些藥物和HSA結(jié)合能夠促進(jìn)藥物的傳輸和藥效的發(fā)揮，但也有些藥物會(huì)因?yàn)檫@種結(jié)合降低了藥效。許多藥物在進(jìn)入人體后都會(huì)產(chǎn)生各種不良的反應(yīng)，而不良的反應(yīng)的原因至今許多仍不清楚［9］。

小分子探針?，摕晒馑仡愃莆颋CLA是一種活性氧化學(xué)發(fā)光探針，它可以和活性氧反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。報(bào)道表明HSA能夠影響FCLA的氧化反應(yīng)過程，顯著增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度［10，11］。蛋白和藥物的相互作用可以通過結(jié)合影響藥物作用強(qiáng)度和時(shí)間的長短，進(jìn)而對藥物的吸收、分布、排泄及其他方面產(chǎn)生重要作用，從而影響其生物活性的發(fā)揮，本研究中則運(yùn)用可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光標(biāo)示氧化反應(yīng)狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光探針FCLA分析研究HSA對藥物產(chǎn)生影響的可能機(jī)制，從而進(jìn)一步揭示體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)過程。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

PBS配制 FCLA(Tokyo Kasei Kogyo Co.，Tokyo，Japan)母液 100μmol/L HSA(purity 96% ，Sigma，St.Louis，Missouri)母 液 50μmol/L，光 敏 劑 (PPIX，50μmol/L，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin)置于-4℃冷藏待用。等溫滴定量熱儀ITC購于MicroCal，MA，USA，型號為VP-ITC.該儀器可測量的溫度范圍為2～80℃，最小可檢測熱效應(yīng)0.125 μJ;等溫?cái)?shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)自帶的 origin 7.0軟件進(jìn)行分析、擬合。激光器為635 nm，semiconductor laser，NL-FBA-2.0-635，nLight Photonics Corporation，Vancouver，WA，購自美國。單光子計(jì)數(shù)儀 PMT，Model MP 952，PerkinElmer Optoelectronics，Wiesbaden，Germany。熱電偶溫度檢測儀:51Ⅱ，Thermometer，F(xiàn)luke，購自美國。

1.2 等溫滴定

整個(gè)實(shí)驗(yàn)溶液溫度為25℃展開實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前對 600μL FCLA(50μmol/L)和 2mL 的 HSA(10μmol/L)脫氣10 min;化合物泵入自動(dòng)注射器中，向反應(yīng)池(1.458mL)的HSA滴定.每次滴定10μL的化合物，共計(jì)30次滴定，首次滴定延遲60 s，兩次滴定時(shí)間間隔為240 s，注射針攪拌速度為416 r/min。FCLA和HSA兩者結(jié)合的熱效應(yīng)要扣除FCLA自身的稀釋熱。

1.3 HSA對FCLA氧化反應(yīng)的增強(qiáng)作用

FCLA(10μmol/L)自氧化檢測及加入 HSA(10μmol/L)后FCLA的自氧化光子計(jì)數(shù)測量。檢測時(shí)間為1 min。配制光敏劑(PPIX，5μmol/L)、HSA(10μmol/L)、FCLA(10μmol/L)的溶液 2mL 在激光(635 nm，50 mW/cm2)的照射下用單光子計(jì)數(shù)儀(Filter，bandpass 530 nm)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。以及FCLA加入滅活的(10μmol/L，80℃水浴15 min)和新鮮的HSA(10μmol/L)的化學(xué)發(fā)光。檢測時(shí)間1 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 HSA對FCLA氧化反應(yīng)速度影響實(shí)驗(yàn)

將HSA母液稀釋成不同濃度的溶液(0-2.5μmol/L)取 2mL分別至于玻璃平皿中。加入 100μmol/L FCLA 200μL，吹打均勻后立即檢測光子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 溫度對催化氧化反應(yīng)速度的影響

將 FCLA(10μmol/L)溶液和 FCLA(10μmol/L)+HSA(10μmol/L)溶液2mL分別置入玻璃平皿，用電加熱器底部均勻加熱，并同時(shí)熱電偶溫度檢測儀測量溫度。為了獲得較低溫度起點(diǎn)，溶液和玻璃皿均預(yù)冷至4℃。在加熱的同時(shí)用光子計(jì)數(shù)器記錄發(fā)光強(qiáng)度變化。

2 結(jié)果

圖1 25℃時(shí)HSA與FCLA在緩沖液中結(jié)合的等溫滴定圖.FCLA，50μmol/L;HSA，10μmol/L;每次滴定10μL，共滴定30次Fig.1 Representative ITC profiles for the titration of FCLA(50μmol/L)into HSA(10μmol/L)at the temperature of 25 ℃ .Everytime 10μL for 30 times.

等溫滴定量熱法(ITC)是用于測量分子間相互作用的方法，已在生命科學(xué)、生物物理、物理化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［12，13］。它獨(dú)一無二的優(yōu)勢在于單次實(shí)驗(yàn)即可得出完整精確的熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N、親和常數(shù)Kb、焓變△H、熵變 T△S、吉布斯自由能△G。圖1為原始滴定等溫線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分別為，N:0.825;Kb:6.77 ×105 L mol-1;△H:5.707 kcal mol-1;T△S:13.877 kcal mol-1:△G:-5.661 kcal mol-1。數(shù)據(jù)表明25℃溶液中，HSA和FCLA兩者在滴定混合中有一個(gè)自發(fā)結(jié)合的過程(△G＜0)并且吸熱，結(jié)合能的變化則證實(shí)了二者的結(jié)合。

圖2 HSA對FCLA化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)作用。圖A:FCLA(10μmol/L)自氧化及 HSA(10μmol/L)對FCLA的自氧化增強(qiáng)。圖B:在光敏反應(yīng)產(chǎn)生的大量活性氧(PPIX，5μmol/L)的刺激下FCLA的化學(xué)發(fā)光。滅活的和新鮮的HSA(10μmol/L)分別被加入到反應(yīng)液中Fig.2 FCLA Chemiluminescence is enhanced by HSA.A:The self oxidation of FCLA(10μmol/L)and the enhancement by HSA(10μmol/L).B:Large amount of reactive oxygen is produced to excite chemiluminescence of FCLA.The active and inactive HSA is added in the solution

圖2表明HSA顯著地提高了FCLA的化學(xué)發(fā)光。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在有氧的條件下，單獨(dú)的HSA不能發(fā)光，而單獨(dú)的FCLA由于自氧化可以產(chǎn)生微弱的發(fā)光。但是當(dāng)HSA加入FCLA溶液時(shí)其化學(xué)發(fā)光被顯著地提高。表明FCLA自氧化反應(yīng)的活化能閾值被HSA降低了。因此，HSA必然和FCLA存在一個(gè)物理結(jié)合反應(yīng)，正是這種結(jié)合引起的相互作用最終導(dǎo)致FCLA氧化閾值的降低。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和檢測HSA和FCLA的結(jié)合效應(yīng)，HSA經(jīng)高溫破壞了其生物活性結(jié)構(gòu)，蛋白三級結(jié)構(gòu)解散。圖二B可以看到在FCLA強(qiáng)氧化實(shí)驗(yàn)中，有活性的HSA明顯提高了化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，而滅活的HSA反而降低了化學(xué)發(fā)光。

圖3 HSA濃度對氧化反應(yīng)速度影響。將不同濃度的HSA溶液(0-2.5μmol/L)2mL置于玻璃皿中，加入100μmol/L FCLA 200μL，檢測光子強(qiáng)度。數(shù)據(jù)點(diǎn)用直線擬合 (R=0.92609)Fig.3 The influence of HSA concentration to oxidation reaction.2mL different HSA concentrations were transmitted in glass vessel，200μL FCLA(100μmol/L)was then added in.Emitted photons were detected.The data were fitted by linear(R=0.92609)

酶解過程是酶與底物結(jié)合后引起反應(yīng)活化能的降低從促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。而酶催化的基礎(chǔ)是和底物的結(jié)合，圖二的結(jié)果恰恰表明了這種結(jié)合。根據(jù)酶催化理論，酶濃度對反應(yīng)速度有影響:當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時(shí)，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即ν=k［E］。因此我們考察了HSA濃度的變化對FCLA反應(yīng)速度的影響。圖三中，當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中底物(FCLA)的濃度足夠大時(shí)，F(xiàn)CLA的反應(yīng)速度和HSA的濃度成正比關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作為生物活性大分子，白蛋白和FCLA結(jié)合后具有提高氧化反應(yīng)速度的作用，類似酶的作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HSA的這種類似酶催化的效應(yīng)，又做了溫度變化實(shí)驗(yàn)。圖四表明溫度變化對HSA催化FCLA化學(xué)反應(yīng)存在影響。其中A圖表明隨著溫度的升高，F(xiàn)CLA分子和氧分子趨向更易發(fā)生反應(yīng)，因此發(fā)光增強(qiáng)，但在溫度超過60℃時(shí)，可觀測到化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的下降。加了HSA的實(shí)驗(yàn)顯示了同樣的結(jié)果，不同的是發(fā)光下降的溫度閾值被延后了。圖B顯示了HSA增強(qiáng)發(fā)光的比率變化，雖然從絕對值上在低于60℃時(shí)反應(yīng)是隨著溫度的增加而增加的，但比率結(jié)果顯示在約20℃時(shí)HSA具有最高的相對催化反應(yīng)效果。

3 討論

圖4 溫度對氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的影響。A:化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系;B:化學(xué)發(fā)光比率與溫度的關(guān)系。將FCLA(10μmol/L)溶液和FCLA(10μmol/L)+HSA(10μmol/L)溶液 2mL 分別置入玻璃平皿，用電加熱器底部均勻加熱，并同時(shí)熱電偶溫度檢測儀測量溫度，同時(shí)用光子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)Fig.4 A:The relation of chemiluminescence and temperature;B:The relation of chemiluminescence ratio and temperature.Temperature influences photons emitting.FCLA(10μmol/L)and FCLA(10μmol/L)+HSA(10μmol/L)solution(2mL)was transmitted into a glass vessel respectively.The vessel was evenly heated.The temperature and emitting photons were detected simultaneously

等溫滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FCLA和HSA是一個(gè)吸熱的結(jié)合過程。同時(shí)由△H ＞0，△S＞0及熱容等數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析表明:疏水作用是兩者結(jié)合的主要作用力。因此判斷結(jié)合位點(diǎn)在HSA的疏水腔中。當(dāng)高溫破壞蛋白三級結(jié)構(gòu)后，疏水腔消失，結(jié)合位點(diǎn)被破壞，對FCLA的發(fā)光增強(qiáng)作用消失。其原因可推測為:有活性的HSA三級結(jié)構(gòu)完整，具有正常的藥物結(jié)合功能區(qū)，因此能夠和FCLA結(jié)合，而結(jié)合降低了氧化反應(yīng)所需的活化能，進(jìn)而促進(jìn)了反應(yīng)提高了化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，而失活的HSA因?yàn)槠淙壗Y(jié)構(gòu)的破壞，不但不能結(jié)合FCLA，反而由于大量裸露的還原性基團(tuán)能夠?qū)钚匝醍a(chǎn)生猝滅反應(yīng)，形成和FCLA的氧化競爭，因此抑制了化學(xué)發(fā)光?？傊Y(jié)合是提高氧化反應(yīng)的關(guān)鍵，類似于酶的催化，HSA在反應(yīng)過程中起到了催化的作用，HSA和FCLA的結(jié)合降低了FCLA分子氧化反應(yīng)所需的活化能，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。

酶的催化對溫度的依賴性很高，過高和過低的溫度都會(huì)影響酶的催化效率。為了研究HSA對FCLA氧化反應(yīng)類酶催化效果，又考察了溫度對HSA催化作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著溫度的升高，分子的動(dòng)能增加，F(xiàn)CLA分子和氧分子趨向更易發(fā)生反應(yīng)，因此發(fā)光逐漸增強(qiáng)。但過高的溫度(圖中約為60℃以上)也同時(shí)導(dǎo)致FCLA激發(fā)態(tài)分子自身的碰撞加劇，從而導(dǎo)致物理猝滅的發(fā)生。但是加了HSA后，由于FCLA和大分子HSA的結(jié)合降低了FCLA分子碰撞的幾率，因而可以在一定程度上抑制這種物理猝滅，使發(fā)光下降的溫度閾值延后。HSA增強(qiáng)發(fā)光的比率變化表明在20℃左右時(shí)HSA具有最強(qiáng)的相對催化效果。另外，結(jié)果顯示，HSA溫度影響曲線也和真正的酶有所區(qū)別，對溫度的敏感性沒有酶那么強(qiáng)，這也是和HSA在體內(nèi)的功能并非催化生化反應(yīng)作用有關(guān)。

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)CLA可以自發(fā)和HAS結(jié)合，通過HSA以類似酶作用的效果降低了FCLA分子氧化反應(yīng)的活化能，導(dǎo)致了FCLA氧化反應(yīng)的增強(qiáng)。利用結(jié)合物FCLA本身是化學(xué)發(fā)光探針，并借助單光子監(jiān)測手段，我們實(shí)時(shí)高靈敏地觀測到了這種影響。血液中的HSA是許多藥物的載體，本研究表明，在設(shè)計(jì)和應(yīng)用藥物時(shí)，HSA和藥物的結(jié)合輸運(yùn)可能會(huì)導(dǎo)致藥物抗氧化或者抗藥物交叉反應(yīng)能力的降低，一些藥物潛在的不良反應(yīng)可能和這個(gè)原因有關(guān)。因此應(yīng)該考慮避免這種結(jié)合導(dǎo)致的藥物副作用，以提高藥物的利用效率，防止副效應(yīng)的產(chǎn)生。本研究對于提高藥物的壽命和藥效的發(fā)揮、降低藥物不良反應(yīng)，進(jìn)行科學(xué)的藥物分子設(shè)計(jì)等具有重要的指導(dǎo)意義。

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