楊國柱，李青南，陳嘉儀，林曉靜，陳 珺，盧 麗，

賈歡歡2，黃 韌2，陸幸妍1

（1.廣東藥學(xué)院新藥功能研究中心 廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.廣東省實驗動物監(jiān)測所 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東 廣州 510633）

臨床上有許多患者需要短期、長期甚至終生使用糖皮質(zhì)激素（gl ucocorticoid，GC），然而GC治療往往會導(dǎo)致骨量丟失，繼而引起骨質(zhì)疏松［1］，骨量丟失程度隨著GC治療劑量和時間的變化而變化，其機制很復(fù)雜，至今尚不清楚。探討GC性骨質(zhì)疏松（gl ucocorticoid－induced osteopor osis， GIOP）疾病的發(fā)生機制的動物模型多為大鼠［2］，但由于制備方法很不規(guī)范［2－4］，如所采取的造模方法、動物類型及觀察時間和部位各異，給研究造成許多不便。

目前普遍認為GC引起骨量丟失的程度與其累積劑量和應(yīng)用時間等有關(guān)［5－6］。本小組曾對雌性大鼠間斷性肌注地塞米松（dexamet hasone，Dex），每次2.5 mg·kg－1［7－8］，每周2次，發(fā)現(xiàn)42和90 d時，Dex可造成皮質(zhì)骨骨量的丟失，但對松質(zhì)骨沒有影響。因此，本研究調(diào)整Dex劑量為1 mg·kg－1、頻率分別為每周2次、4次和6次，持續(xù)30 d，采用骨形態(tài)計量學(xué)方法［7］觀察3月齡SD大鼠脛骨皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的改變，以期為GIOP模型標準化及為其預(yù)防和未來臨床干預(yù)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及主要儀器

Dex磷酸鈉注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，規(guī)格1 ml∶2 mg；批號110303）。戊巴比妥鈉AR（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑），EDTA（Bioshar p公司產(chǎn)品），多聚甲醛（天津市福盆化學(xué)試劑廠），乙醇（天津市百世化工有限公司）。Leica EG1160型包埋機，Leica RM2500型切片機（德國Lecia公司），Oly mpic IX51生物顯微鏡，骨形態(tài)計量學(xué)測量系統(tǒng)（美國Osteo Metrics公司）。

1.2 動物與分組

3月齡SPF級雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供〔質(zhì)量合格證編號：SCXK（粵）20100020〕。分籠飼養(yǎng)于室溫24～28℃，相對濕度50%～70%的清潔環(huán)境中，隔日更換墊料，自由攝食和攝水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組8只：正常對照組僅肌內(nèi)注射生理鹽水，Dex組肌內(nèi)注射 Dex 1.0 mg·kg－1，按照給藥次數(shù)，分為2次，4次和6次；每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，共計給藥30 d。

1.3 骨組織切片制作

給藥30 d后戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟抽血處死，取右側(cè)脛骨鋸出上段（pr oxi mal tibia metaphyses，PTM）和中段（middle part of tibia shaft，TX），經(jīng)10%EDTA脫鈣處理后行石蠟包埋，切4μm薄片，HE染色。

1.4 骨組織形態(tài)計量學(xué)檢測

本實驗采用BIOQUANT OSTEO骨組織形態(tài)圖像分析系統(tǒng)（BIOQUANT Image Anal ysis Corporation）用以測量骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)［7］。骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)分為靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)，通過靜態(tài)參數(shù)可以分析骨量和骨的結(jié)構(gòu)，動態(tài)參數(shù)為反映骨形成和骨吸收的指標。

松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)包括反映骨量的骨小梁面積百分數(shù)（trabecular area，%Tb.Ar）、反映骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)的骨小梁寬度（trabecular width，Tb.Wi，μm）、骨小梁數(shù)量（trabecular nu mber，Tb.N）和骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp，μm）。皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)包括反映骨外膜骨形成的骨組織總面積（total tissue area，T.Ar）、反映內(nèi)外骨面變化的皮質(zhì)骨總面積（cortical area，Ct.Ar）、反映骨內(nèi)膜面骨吸收與骨形成情況的骨髓腔面積（marr ow area，Ma.Ar）、皮質(zhì)骨厚度 （cortical bone thickness，Ct.Th）、骨外膜面周長（periosteal peri meter，P－Pm）和骨內(nèi)膜面周長（endocortical peri meter，EPm）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同頻率給予地塞米松對大鼠骨組織的影響

脛骨上段松質(zhì)骨HE染色結(jié)果顯示，正常對照組骨小梁排列密集，小梁寬、間距小，骨小梁之間的連接較多（圖1 A1）；每周2次組與正常對照組相比無明顯變化（圖1 A2），4次組和6次組骨小梁寬度變窄，其他指標無明顯肉眼可見的變化（圖1 A3，圖1A4）。

脛骨中段皮質(zhì)骨的HE染色結(jié)果顯示，正常對照組的皮質(zhì)骨切片呈現(xiàn)淡紅色、中空環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1B1）；每周2次和4次組未見明顯差異（圖1B2，1B3）；6次組 Ct.Th和 Ct.Ar相對減少（圖1B4）。

Fig.1 Effect of dexamethasone（Dex）at different frequency on proxi mal tibia metaphyses（A）and middle part of tibia shafts（B）of rats（HE×2）.Dex 1 mg·kg－1 was given，i m，for t wice，four and six ti mes a week，respectively，and lasting 30 d.1：nor mal contr ol gr oup；2：t wice a week gr oup；3：f our ti mes a week group；4：six ti mes a week group.Arrows show the trabeculae.

2.2 不同頻率給予地塞米松對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨形態(tài)計量參數(shù)的影響

如表1所示，每周2次 Dex，%Tb.Ar和Tb.Wi有所下降，但與正常對照相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而4次和6次組脛骨上段，%Tb.Ar和Tb.Wi明顯減少（P＜0.05），說明Dex給藥30 d后，4次和6次組大鼠松骨量出現(xiàn)了骨量和骨結(jié)構(gòu)的破壞，而2次組沒有改變。上述3組給予Dex 1 mg·kg－1，對Tb.N和Tb.Sp無顯著影響，說明短時間30 d Dex主要表現(xiàn)為影響松質(zhì)骨骨小梁的寬度。

Tab.1 Effect of Dex 1 mg·kg－1 on histomor phometric parameters of the pr oxi mal tibia metaphyses of rats

2.3 不同頻率給予地塞米松對大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨形態(tài)計量參數(shù)的影響

如表2所示，與正常對照組相比，每周2次、4次和6次組T.Ar和P－Pm均顯著降低（P＜0.05），但對Ma.Ar和E－Pm無影響。6次組還可顯著降低Ct.Th和%Ct.Ar（P＜0.05），而其他兩組對此無影響。說明短時間內(nèi)皮質(zhì)骨對GC較為敏感，2次組已出現(xiàn)骨量的減少。而4次組Ct.Th與正常對照組比較無顯著差異，而2次和6次組的Ct.Th均減少，這可能與Dex的用藥頻率有關(guān)。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，30 d不同頻率GC給藥后，每周2次組大鼠松質(zhì)骨各項指標無明顯變化；4次和6次組大鼠的%Tb.Ar，Tb.Wi明顯減少，但Tb.N，Tb.Sp未見變化，說明4次和6次組大鼠松質(zhì)骨的骨微細結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生退化，骨量和骨結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了改變。提示在模型制作過程中，可以考慮在保持原有劑量的基礎(chǔ)上，加大GC給藥的頻率，這樣可以縮短模型制作時間，節(jié)約制作成本，從而降低動物的損耗。鑒于大鼠骨骼的長度、質(zhì)量和骨密度在1～3月齡呈急速生長，3個月后骨生長速率變得平緩，直到6月齡后骨骼可保持很長一段時間穩(wěn)定［9］，推測每周2次組的松質(zhì)骨造模結(jié)果不理想，可能是大鼠處于骨平緩的生長塑造期，為保持骨密度和生物學(xué)作用，骨量發(fā)生了從皮質(zhì)骨向松質(zhì)骨的轉(zhuǎn)移［8－9］，觀察時間短和用藥頻率較低進一步掩蓋了松質(zhì)骨應(yīng)有的改變。

不同頻率給予Dex對大鼠皮質(zhì)骨作用也不盡相同。上述組T.Ar均明顯減少；尤以6次組表現(xiàn)明顯，T.Ar，Ct.Th，Ct.Ar均明顯減少。在每周2次組皮質(zhì)骨已經(jīng)出現(xiàn)骨量減少，隨頻率的增加骨丟失越發(fā)明顯，說明在調(diào)整頻率和劑量、時間后，短時間內(nèi)即可觀察到GC對皮質(zhì)骨的影響。目前研究一致認為，GC通過破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收及抑制成骨細胞介導(dǎo)的骨形成引起骨質(zhì)疏松，其中GC對皮質(zhì)骨的影響主要是使骨內(nèi)外膜的骨形成減少，同時骨內(nèi)膜面的骨吸收增加，從而出現(xiàn)皮質(zhì)骨變薄，骨髓腔增大的情況［10］。本實驗給Dex 3個頻率組骨外膜周長均減少，骨內(nèi)膜周長與正常對照組無差異，骨外膜周長與內(nèi)膜周長變化不一致，可能是由于成骨細胞在骨外膜面分布比骨內(nèi)膜面的多，成骨細胞作為最主要的骨形成細胞，也是GC作用于骨骼的主要靶點，對GC有著高敏感性；GC不僅降低成骨細胞的分化和成骨能力，而且還促進了成骨細胞和骨細胞的凋亡［8，11－12］。因本實驗觀察時間較以往稍短，更加凸顯了成骨細胞較破骨細胞對Dex應(yīng)激的敏感和迅速，骨外膜的骨形成明顯受抑制，尤其每周2次組表現(xiàn)更為明顯，這也與Tsa mpalier os等［13］和Yang等［14］的觀點一致，可能與GC作用后，導(dǎo)致皮質(zhì)骨應(yīng)激性地縮小，骨骼縱向生長變緩，從而維持骨密度不變或者增加，進而維持骨骼原有的生物力學(xué)功能有關(guān)。

Tab.2 Effect of Dex 1 mg·kg－1 on histomor phometric parameters of middle part of tibia shaft cortical bone of rats

值得注意的是，每周4次組Ct.Th與正常對照組比較沒差異，而2次和6次組Ct.Th均減少，這可能與Dex的用藥頻率有關(guān)［6］。一方面，4次組可能降低了大鼠成骨細胞對Dex的敏感性，從而減弱了Dex引起的骨量丟失，皮質(zhì)骨的骨形成和骨吸收達到一個穩(wěn)態(tài)，皮質(zhì)骨厚度得以維持。另一方面，也可能與GC對成骨的雙向作用有關(guān)［14］。2次組皮質(zhì)骨的骨形成減慢，得以維持松質(zhì)骨骨結(jié)構(gòu)和骨量沒有損失，而6次組，則皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的骨形成均減緩，即使GC引起骨從皮質(zhì)骨到松質(zhì)骨轉(zhuǎn)移，仍不足以維持松質(zhì)骨的骨結(jié)構(gòu)和骨量，同時皮質(zhì)骨的骨量大大減少，GC對破骨細胞的作用得以凸顯。因此，2次和6次組分別凸顯了外膜骨形成的抑制和內(nèi)膜骨吸收的促進兩個作用。

綜上所述，經(jīng)調(diào)整Dex的劑量、頻率和時間后，30 d給藥即可觀察到大鼠脛骨的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨出現(xiàn)相應(yīng)骨量減少的改變，隨著頻率的增加，不同頻率組的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的表現(xiàn)各異。本研究也是首次報道頻率對GIOP建模的影響，以及皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨同時對GC產(chǎn)生的不同應(yīng)激反應(yīng)，提示建立GIOP模型時，應(yīng)充分考慮不同類型骨骼的變化情況，合理設(shè)計用藥劑量和頻率，也為臨床上GIOP的預(yù)防和干預(yù)、GC的用藥方式提供一定的實驗基礎(chǔ)。

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