韓春光，黃火高，王 瓊，高志清，彭明麗，承京霞，劉永學(xué)

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理學(xué)與毒理學(xué)研究室，北京 100850;2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院干部保健科，北京 100037)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進(jìn)行性的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎和對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣?。近年來，免疫分子在RA發(fā)病中的作用越來越受到人們重視?？乖岢始?xì)胞通過T細(xì)胞受體(T cell receptors，TCR)與T細(xì)胞識別，后者在B7共刺激因子的作用下被活化，活化的T細(xì)胞再激活巨噬細(xì)胞，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子進(jìn)一步作用于巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞和成骨細(xì)胞，通過細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶和NF-κB受體激活物的配基等導(dǎo)致軟骨和骨破壞[1]。由此提示，TCR抗體對RA可能具有一定的治療作用。本研究制備DBA/1小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型，觀察鼠源 TCR(mouse TCR，mTCR)單抗對RA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和儀器

DBA/1小鼠，體質(zhì)量20～24 g，18周齡，雄性，購自上海藥物研究所，SPF級飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號:中科動(dòng)管會第001號。地塞米松磷酸鈉注射液，天津金耀氨基酸有限公司;mTCR單抗，美國Gene Tex公司。牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑，美國Chondrex公司。Luminex200型多功能流式液相芯片分析儀，美國Millipore公司。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備和給藥

將DBA/1小鼠隨機(jī)分為正常對照、模型、地塞米松0.5 mg·kg－1和 mTCR 單抗25 mg·kg－1治療組，每組6只。CIA小鼠模型的制備按照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。除正常對照組外，將牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑充分混合，制成膠原乳劑，含Ⅱ型膠原2 g·L－1，每只小鼠尾根部皮內(nèi)1次注射100 μl，將注射當(dāng)日記為第1天，于第21天加強(qiáng)誘導(dǎo)1次。地塞米松治療組于第29～41天皮下注射地塞米松磷酸鈉注射液，隔日一次;mTCR單抗治療組分別于第0和第21天皮下注射給藥1次;正常對照和模型對照組皮下注射等體積生理鹽水。

1.3 體質(zhì)量和足掌厚度測量、關(guān)節(jié)炎評分及CIA發(fā)生率計(jì)算

以電子天平動(dòng)態(tài)稱量小鼠體質(zhì)量，每周2次。以游標(biāo)卡尺測量小鼠足掌厚度。關(guān)節(jié)炎炎癥指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn):0分，關(guān)節(jié)正常;1分，關(guān)節(jié)輕微紅腫;2分，關(guān)節(jié)紅腫嚴(yán)重，累及整個(gè)關(guān)節(jié);3分，足爪或關(guān)節(jié)功能障礙，關(guān)節(jié)僵硬。每只小鼠的關(guān)節(jié)炎癥的總評分為四肢評分的總和，每只小鼠的最高分值為12分，關(guān)節(jié)總評分大于1的小鼠為建模成功小鼠[3]。

1.4 踝關(guān)節(jié)組織病理變化觀察

連續(xù)觀察到給藥后第60天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，取踝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織切片，HE染色，鏡下觀察組織病理改變，包括關(guān)節(jié)組織炎癥細(xì)胞浸潤和骨骼破壞。

1.5 血清細(xì)胞因子測定

連續(xù)觀察到給藥后第60天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取血清，通過Luminex200液晶芯片分析平臺，測定小鼠血清 γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素 4(interleukin-4，IL-4)的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 mTCR單抗對CIA模型小鼠體質(zhì)量和足腫脹度的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠體質(zhì)量無明顯變化。CIA發(fā)生發(fā)展過程中，小鼠的受累關(guān)節(jié)首先表現(xiàn)為腫脹，足掌厚度明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，第31～59天，地塞米松和mTCR單抗治療組足掌厚度明顯降低(P＜0.01)(圖1)。

Fig.1 Effect of mouse monoclonal antibody of T cell receptors(mTCR mAb)on thickness of foot palm of collagen typeⅡinduced arthritis(CIA)model mice.On the 1st and 22nd day，bovine typeⅡcollagen and complete Freund adjuvant emulsion was injected intradermally in order to prepare the CIA mouse model.From the 29th to 41st day，dexamethasone sodium phosphate injection 0.5 mg·kg －1was sc given to the mice of dexamethasone treatment group every other day.The mice of mTCR mAb group were sc injected mTCR mAb 25 mg·kg －1on the 0(before model preparation)and 21st day，respectively.After administration for 60 d，the thickness of foot palm was mearsured.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 mTCR單抗對CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

如圖2所示，自第28天發(fā)病開始，CIA模型組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸增加(P＜0.01)。與模型組比較，地塞米松和mTCR單抗治療組小鼠的炎癥指數(shù)明顯減小(P＜0.05，P＜0.01)。

Fig.2 Effect of mTCR mAb on joint inflammatory index in CIA model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 mTCR單抗對CIA模型小鼠CIA發(fā)生率的影響

從第29天開始，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫和關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等典型的CIA病變。第42天，模型組CIA發(fā)生率已達(dá)6/6，地塞米松和mTCR單抗治療組分別為2/6和1/6;第49天，模型組和地塞米松治療組CIA發(fā)生率維持不變，mTCR單抗治療組升高為5/6(表1)。

Tab.1 Effect of mTCR mAb on incidence of CIA in DBA/1 mice

2.4 mTCR單抗對CIA模型小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響

與正常組(圖3A)相比，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤，骨侵蝕明顯(圖3B);與模型組比較，地塞米松和mTCR單抗治療組小鼠僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤，而且骨侵蝕不明顯(圖3C，D)。

Fig.3 Effect of mTCR mAb on pathological changes of ankle joints in CIA model mice(200 ×).See Fig.1 for the mouse treatment.A:normal control;B:model;C:dexamethasone;D:mTCR mAb.?:bony erosion;↑:inflammatory cells infiltrate.

2.5 mTCR單抗對 CIA模型小鼠血清 IFN-γ，IL-4和TNF-α含量的影響

表2結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清IL-4含量明顯降低(P＜0.05)，TNF-α 含量明顯增加(P＜0.01);與模型組相比，地塞米松和mTCR單抗治療組小鼠IL-4含量顯著增加(P＜0.05)，TNF-α明顯降低(P＜0.05);各組小鼠血清 IFN-γ含量無明顯變化。

Tab.2 Effect of mTCR mAb on serum concentration of interferon-γ(IFN-γ)，interleukin-4(IL-4)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in CIA model mice

3 討論

RA是一種常見的自身免疫性疾病。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)紊亂是其發(fā)病機(jī)制之一。據(jù)報(bào)道，RA受累關(guān)節(jié)局部T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而且病變程度與T細(xì)胞聚集程度密切相關(guān)[4]，提示T細(xì)胞及其有關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)參與了RA的發(fā)生發(fā)展過程。因此，免疫反應(yīng)與炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等各自作用和相互關(guān)系已成為目前治療RA研究的重要內(nèi)容之一[5]。

RA涉及的細(xì)胞免疫反應(yīng)主要與某些特定的T細(xì)胞亞群有關(guān)。TCR是成熟T細(xì)胞的特征性標(biāo)志，與人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)形成HLA-抗原-TCR復(fù)合物，并激活T細(xì)胞，是T細(xì)胞表面特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，也是TCR單抗有望成為RA防治藥物的理論基礎(chǔ)[6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mTCR單抗可以降低CIA的發(fā)生率，明顯減輕足掌腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)，明顯降低炎癥細(xì)胞浸潤和骨破壞。由此提示，mTCR單抗對CIA具有一定的治療作用，也進(jìn)一步證實(shí)T細(xì)胞參與RA的發(fā)病過程。但自給藥后第45天開始，mTCR單抗治療組足掌厚度和炎癥指數(shù)有所升高;第49天以后CIA發(fā)生率升高，接近模型組;上述結(jié)果提示本研究mTCR單抗的給藥方案需進(jìn)一步改進(jìn)，如增加給藥次數(shù)等。

RA發(fā)病過程中 T輔助細(xì)胞1(T helper 1，Th1)和Th2平衡失調(diào)[7]，它們主要通過分泌不同的細(xì)胞因子影響RA的發(fā)展過程。Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，IL-2和TNF-α等，參與細(xì)胞免疫反應(yīng);Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和IL-10等，參與體液免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠血清TNF-α水平顯著高于正常對照組，IL-4水平低于正常對照組;與模型組相比，地塞米松和mTCR單抗治療組血清TNF-α含量明顯降低，IL-4含量明顯升高，提示CIA模型小鼠Th1/Th2平衡失調(diào)，地塞米松和mTCR單抗均可恢復(fù)其平衡，mTCR單抗對CIA的治療作用可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平、恢復(fù)Th1/Th2平衡有關(guān)。

[1]Xi ZD， Zhang DQ， Zhang YY， Zang JW.Research advances on collagen-induced arthritis in mice[J].Nat Mag(自然雜志)，2003，25(1):46-41.

[2]Cheng JX，Han CG，Wang Q，Xu JP，Liu YX.Characterization of collagen induced arthritis in DBA/1 mice[J].Pharm J Chin PLA(解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào))，2007，23(2):94-96.

[3]Aerts NE，Dombrecht EJ，Ebo DG，Bridts CH，Stevens WJ，De Clerck LS. Activated T cells complicate the identification of regulatory T cells in rheumatoid arthritis[J].Cell Immunol，2008，251(2):109-115.

[4]Boissier MC，Assier E，Biton J，Denys A，F(xiàn)algarone G，Bessis N.Regulatory T cells(Treg)in rheumatoid arthritis[J].Joint Bone Spine，2009，76(1):10-14.

[5]Kato I， Endo-Tanaka K， Yokokura T. Suppressive effects of the oral administration of Lactobacillus casei on typeⅡ collagen-induced arthritis in DBA/1 mice[J].Life Sci，1998，63(8):635-644.

[6]Cush JJ， Lipsky PE. Phenotypic analysis of synovial tissue and peripheral blood lymphocytes isolated from patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，1988，31(10):1230-1238.

[7]Raychaudhuri S. Recentadvances in the genetics of rheumatoid arthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2010，22(2):109-118.