袁玉國，于寶利，宋紹征，周峰，張利清，顧迎迎，禹明慧，成勇

揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

基因組靶向修飾是近年來生命科學(xué)研究的熱點之一，特別是在基因功能分析、生產(chǎn)模式動物、治療人類疾病和優(yōu)良家畜育種等方面，基因組靶向修飾具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。應(yīng)用同源重組可實現(xiàn)對目的基因靶向修飾，但由于其費(fèi)時、效率低 (10-5～10-7)等缺點，成為限制該項技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸之一[1-2]。利用人工鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs)可引入DNA定點DSBs (Double-strand breaks，DSBs)以高效介導(dǎo)基因定點突變，極大提高基因打靶效率 (甚至可達(dá)到 10%以上效率)，從而給基因組靶向修飾帶來了新的希望[2-4]。ZFNs由一個識別特定DNA序列的鋅指蛋白域和非特異性核酸內(nèi)切酶 (FokⅠ)組成，其作用機(jī)理是 DNA結(jié)合域與特定 DNA序列結(jié)合，與之相連的非特異性核酸內(nèi)切酶隨之發(fā)揮剪切作用，在結(jié)合位點產(chǎn)生斷裂，促進(jìn)同源重組，提高定點突變和置換頻率[5]。每個鋅指蛋白可特異性識別并結(jié)合DNA鏈上的3個連續(xù)堿基，一個由3個及以上的鋅指蛋白組成的鋅指蛋白域可結(jié)合9個及以上堿基長度的靶位點，并且改變鋅指蛋白中的幾個殘基可產(chǎn)生新的具有不同DNA結(jié)合特異性的ZFNs[6]。因此，可通過基因工程改造鋅指結(jié)構(gòu)域使鋅指核酸酶針對復(fù)雜基因組里的特定DNA序列，借助內(nèi)源DNA的修復(fù)機(jī)制可精確修飾高等生物的基因組，不僅可以將基因組靶向修飾的效率提高幾個數(shù)量級，而且具有極高的特異性[7-8]。隨著ZFNs介導(dǎo)基因打靶技術(shù)的發(fā)展和成熟，農(nóng)業(yè)育種和包括為人類疾病和器官移植的大動物模型在內(nèi)的醫(yī)學(xué)研究等將毫無疑問受益于此項新技術(shù)[1,4]。在基因和細(xì)胞治療方面，利用ZFNs對人體細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的不同靶基因座進(jìn)行靶向修飾，均獲得了較好的效率[9-10]。

目前，哺乳動物轉(zhuǎn)基因大多采用體細(xì)胞克隆的方法，在此過程中，篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞必須應(yīng)用抗性或標(biāo)記基因，這就使得獲得的轉(zhuǎn)基因動物攜帶抗性或標(biāo)記基因，但轉(zhuǎn)基因動物抗性或標(biāo)記基因的生物安全性是一個必須解決的問題，而探索應(yīng)用ZFNs進(jìn)行標(biāo)記基因刪除的研究是一項極有意義的工作。目前，ZFNs是否能介導(dǎo)山羊體細(xì)胞基因組靶向修飾以及修飾方式未見報道，本實驗構(gòu)建并表達(dá)針對EGFP基因的ZFNs進(jìn)行轉(zhuǎn)基因山羊胎兒成纖維細(xì)胞打靶的研究，以揭示ZFNs靶向修飾 EGFP基因的方式和效率，為ZFNs結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動物標(biāo)記基因敲除、提高生物安全性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pMLM290 (Addgene plasmid 21872)和pMLM292 (Addgene plasmid 21873)購自addgene公司；質(zhì)粒 pAPLM由本實驗室保存；實驗羊購自高郵市菱唐鄉(xiāng)；各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；DNA純化試劑盒購自 QIAGEN公司；轉(zhuǎn)染液購自 Eppendorf公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自HyClone公司；核移植相關(guān)試劑購自 Sigma公司。

1.2 人工鋅指核酸酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將 pMONO-neo-GFP基因序列 (www.invivogen.com)輸入到 CoDA軟件 (www.zifit.partners.org)中進(jìn)行分析，選取EGFP編碼序列上的一個靶位點 (ACAATCTTCtttaagGATGA TGGA)進(jìn)行鋅指蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 (表 1)。人工合成表達(dá)識別靶序列左右側(cè)3個三聯(lián)體氨基酸序列的DNA (EGFP-L ZFNs sequence，EGFP-R ZFNs sequence，見圖1)，用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后，凝膠回收276 bp片段。同時用XbaⅠ和BamHⅠ分別雙酶切 pMLM290和 pMLM292質(zhì)粒，線性化長片段再用連接酶與上述的 276 bp片段分別連接構(gòu)建成左右側(cè)載體。構(gòu)建正確的載體用 ApaLⅠ和 NruⅠ雙酶切，膠回收 3 313 bp片段用于細(xì)胞打靶的研究。

1.3 轉(zhuǎn)基因克隆胎兒成纖維細(xì)胞系的建立

用SalⅠ和NotⅠ酶切、膠回收含EGFP表達(dá)框的質(zhì)粒pAPLM片段[11]，稀釋成2～3 ng/μL用于單細(xì)胞基因注射。在Eppendorf顯微操作系統(tǒng)中進(jìn)行胎兒成纖維細(xì)胞基因注射，具體方法見文獻(xiàn)[12]。G418篩選后獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作供核細(xì)胞。山羊超數(shù)排卵、手術(shù)取卵、卵母細(xì)胞去核、移核及胚胎移植操作方法同文獻(xiàn)[13]。移植受體35 d B超妊娠檢查，懷孕受體手術(shù)取胎兒建立轉(zhuǎn)基因克隆胎兒成纖維細(xì)胞系 (2#)，方法同前。細(xì)胞凍存于液氮中備用。

1.4 ZFNs電轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞及FACS分析

復(fù)蘇2#細(xì)胞，培養(yǎng)至70%～80%匯合時進(jìn)行電轉(zhuǎn)染含左右側(cè)3 313 bp的ZFNs，條件同上。同時共轉(zhuǎn)染用ApaLⅠ和NruⅠ雙酶切pMLM290和pMLM292片段作對照。轉(zhuǎn)染細(xì)胞電轉(zhuǎn)染后分2份，一份稀釋成單細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，另一部分培養(yǎng)在六孔板中，在第6天時，0.25%胰酶消化細(xì)胞，加D-hank’s吹打分散、離心，重復(fù)3次，用含1% FCS的 D-hank’s吹打細(xì)胞，然后細(xì)胞懸浮于D-hank’s中，以1×106的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行FACS熒光分析，實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞EGFP基因序列突變分析

96孔板中細(xì)胞長滿后，GFP觀察呈陰性的細(xì)胞傳至48孔板，生長至90%匯合時，收集細(xì)胞，用天根細(xì)胞基因組 DNA提取試劑盒提取DNA。以DNA為模板，用跨突變區(qū)的特異性引物 (Forward: 5￠-GCTGGATGGTGATGTGAATG G-3￠; Reverse: 5￠-GTGTTCTGCTGGTAATGGTC TGC-3￠)PCR擴(kuò)增484 bp產(chǎn)物，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s；72 ℃延伸5 min。然后將PCR產(chǎn)物克隆至T載體上，挑取10個克隆送上海生工生物公司測序。

表1 EGFP上ZFNs靶位點及其鋅指氨基酸序列Table 1 EGFP ZFNs target sites and amino-acid sequences of designed ZF recognition helices

圖1 ZFNs識別區(qū)左右側(cè)編碼序列Fig. 1 Left and right coding sequence of ZFNs.

2 結(jié)果

2.1 人工鋅指核酸酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將EGFP基因序列輸入CoDA軟件中，將條件設(shè)置5～6個，進(jìn)行分析，找到一個鋅指蛋白識別編碼綠色熒光蛋白基因的靶位點，如表2所示左側(cè)3個三聯(lián)體DNA是TGTGATGAA，右側(cè)3個三聯(lián)體DNA是GGAGATGAT，左右側(cè)3個鋅指蛋白所對應(yīng)的氨基酸序列和編碼氨基酸所對應(yīng)的DNA序列見EGFP-R ZFNs和EGFP-L ZFNs sequence，斜體序列為酶切位點。人工合成這兩段 DNA序列，用 XbaⅠ和BamHⅠ雙酶回收后分別插入到pMLM290和pMLM292載體中，構(gòu)建成一對鋅指核酸酶表達(dá)載體 pLZFE1729和pRZFE1729 (圖2)，用BamHⅠ酶切均可有5 973 bp條帶 (圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 轉(zhuǎn)基因克隆胎兒成纖維細(xì)胞系的建立

運(yùn)用單細(xì)胞基因顯微注射的方法對培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞進(jìn)行注射，細(xì)胞經(jīng)G418篩選后獲得了兩個單克隆細(xì)胞株，且在熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光。用這兩株細(xì)胞進(jìn)行了2次核移植實驗，共超排了8只供體山羊，獲得了57枚MII期卵母細(xì)胞，將29枚激活胚移植到4只受體中，其中3只35 dB超檢查呈陽性，取2#受體羊胎兒，建立了2#-1和2#-2兩個胎兒細(xì)胞系。

2.3 打靶細(xì)胞FACS分析

圖2 pLZFE1729和pRZFE1729質(zhì)粒圖Fig. 2 Plasmids of pLZFE1729 and pRZFE1729. CMV: CMV promoter; NLS: SV40 nuclease localization signal; ZF:sequence of EGFP-L ZFNs sequence and EGFP-R ZFNs; Fok I: Fok I nuclease; PA: BGH polyadenylation sequence;SV40: SV40 early promoter and origin; Blas: blasticidin resistance gene.

圖3 質(zhì)粒pLZFE1729和pRZFE1729的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pLZFE1729 and pRZFE1729 by enzyme digestion. M: marker T14; 1, 3: plasmid of pLZFE1729 and pRZFE1729; 2, 4: pLZFE1729 and pRZFE1729 digested with BamH I.

pLZFE1729和pRZFE1729載體酶切回收后共電轉(zhuǎn)染2#-1細(xì)胞，在第6天收集細(xì)胞進(jìn)行FACS分析，轉(zhuǎn)染鋅指核酸酶的細(xì)胞僅有 0.2%細(xì)胞有綠色熒光，而對照組細(xì)胞中有5%的細(xì)胞有可見綠色熒光 (圖4)，兩者存在差異，表明構(gòu)建的鋅指核酸酶轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞EGFP基因有切割左右或突變作用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)綠色熒光的比例減少。

2.4 突變靶序列測序分析

PCR擴(kuò)增細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的靶序列區(qū)域，產(chǎn)物測序結(jié)果與正常序列經(jīng)Blast軟件比對結(jié)果顯示，在外顯子GTTAC (1 894 bp位置)后增加一個堿基G (圖5)，將突變后的EGFP編碼序列輸入蛋白翻譯軟件進(jìn)行分析，編碼框發(fā)生改變，其相應(yīng)的氨基酸由原先的239個變成156個。

3 討論

目前構(gòu)建人工鋅指核酸酶的方法有模塊組裝 (Modular assembly，MA)、寡聚文庫構(gòu)建(Oligomerized pool engineering，OPEN)、上下文依賴組裝 (Context-dependent assembly，CoDA)等方案[14]，為方便廣大研究人員，鋅指協(xié)會開發(fā)了一個鋅指靶序列搜索工具 (Zinc finger targeter，ZiFiT，http://zifit. partners.org/ZiFiT/)，輸入特定序列并設(shè)置一定參數(shù)，可用于尋找到適宜于這3種方案的的3-三聯(lián)子目標(biāo)序列，并對所得靶位點構(gòu)建 ZFN成功可能性進(jìn)行評估。本實驗運(yùn)用CoDA方法將EGFP編碼序列輸入到該網(wǎng)站上進(jìn)行分析，在編碼序列上找到一個靶位點，并將獲得的三聯(lián)子對應(yīng) DNA序列連接到含有FokⅠ核酸內(nèi)切酶的通用質(zhì)粒 (pMLM290和pMLM292)中，即構(gòu)建成一對人工鋅指核酸酶表達(dá)質(zhì)粒 (pLZFE1729和pRZFE1729)。

圖4 FACS分析綠色熒光強(qiáng)度Fig. 4 Analysis for EGFP fluorescence intensity by FACS. In the ZFNs-treated cells (S1-1796, S1-1796-2), the number of cells expressing of EGFP was 0.2%. In the control (S1-1796-3), the number of cells expressing of EGFP was 5%.

圖5 突變細(xì)胞PCR產(chǎn)物序列Blast比對結(jié)果Fig. 5 Blast result of PCR product of mutant cells.

基因敲除或突變以研究基因功能和獲得動物模型是一項非常有用的方法。傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)如同源重組效率低且需要長期的藥物篩選，目前僅在小鼠和人上獲得胚胎干細(xì)胞，因而限制了該技術(shù)在家畜上的應(yīng)用。培養(yǎng)體細(xì)胞打靶效率低也是體細(xì)胞核移植技術(shù)較難應(yīng)用于大型家畜上的主要原因。隨著ZFNs技術(shù)的發(fā)展和逐漸成熟，其在哺乳動物基因打靶上的優(yōu)勢已逐漸顯現(xiàn)。通過顯微注射的方法將ZFNs質(zhì)?；騧RNA注射到胚胎原核，出生大鼠基因敲除效率最高可達(dá) 40%，并且可通過生殖系遺傳給后代[15]。由于用顯微注射方法產(chǎn)生的動物存在嵌合體等缺點，且需要大量的受體、繁殖周期長，并需要大量的飼養(yǎng)成本，對于大型哺乳類動物而言，該方法存在很大的風(fēng)險[16]。針對細(xì)胞中特定基因設(shè)計特異性 ZFNs，通過對細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染 ZFNs質(zhì)?；?mRNA可提高打靶效率，同時結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得基因敲除動物[16-19]，可解決傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)由于長期藥物篩選導(dǎo)致細(xì)胞活力差和獲得更多的單克隆打靶細(xì)胞系等問題。為了驗證所構(gòu)建的ZFNs有效性，同時為以后獲得不含熒光蛋白山羊奠定基礎(chǔ)，本實驗將ZFNs片段轉(zhuǎn)染含EGFP基因的原代克隆山羊胎兒成纖維細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞發(fā)綠色熒光的比例降低了4.8%，初步證明了構(gòu)建的ZFNs有效性。Watanable等[20]用轉(zhuǎn)基因豬原代胎兒成纖維細(xì)胞的EGFP基因進(jìn)行ZFNs打靶，其細(xì)胞發(fā)綠色熒光的比例降低了15%，與本實驗獲得的結(jié)果基本相似，應(yīng)用ZFNs消除或降低熒光蛋白的模式不僅在豬上有效，而且在山羊上也可得到類似的結(jié)果。作者推測獲得的轉(zhuǎn)基因克隆胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)熒光的比例較低，可能與基因的甲基化或乙?；档土藢φ占?xì)胞的熒光數(shù)目所導(dǎo)致，與我們前期的報道類似[13]。

ZFNs技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其對基因靶向敲除的效率和特異性有待進(jìn)一步提高，尤其對靶位點的突變存在如堿基缺失、插入等多種方式，甚至存在脫靶現(xiàn)象也時常發(fā)生。本實驗對打靶細(xì)胞PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，靶序列及附近上下游序列無突變，僅在距靶序列下游180 bp左右位置插入1個堿基G，這種突變方式可能由于構(gòu)建的ZFNs特異性較差而存在脫靶現(xiàn)象。Watanable等報道其 EGFP序列突變方式有堿基插入、缺失和替換，并且突變發(fā)生在靶序列位置或其上、下游附近位置，其中插入的堿基為4 bp，缺失的堿基為1～15 bp，替換的堿基為1 bp。同樣在豬、牛等哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源基因上也同樣存在類似的結(jié)果[16-19]。在本實驗中，構(gòu)建的ZFNs產(chǎn)生的突變方式雖然在距靶序列較遠(yuǎn)位置插入1個堿基G，但其突變?nèi)园l(fā)生在編碼綠色熒光蛋白的外顯子位置上，不僅造成 83個氨基酸缺失，而且從152～156的5個氨基酸發(fā)生突變，其表達(dá)的蛋白分子量大小由正常的26.9 kDa變成17.6 kDa，這可能是導(dǎo)致有熒光細(xì)胞減少的分子生物學(xué)原因。從實驗結(jié)果來看，ZFNs轉(zhuǎn)染細(xì)胞靶位點雖然出現(xiàn)異位現(xiàn)象，但在特異性位點附近還是發(fā)生了突變，并使綠色熒光細(xì)胞比例下降，什么原因?qū)е旅摪行枰M(jìn)一步研究。

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