淫羊藿苷與金雀異黃酮對大鼠峰值骨量的影響

成 魁，葛寶豐，甄 平，陳克明，馬小妮，周 建，宋 鵬，馬慧萍

中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 1骨科研究所 2藥劑科，蘭州730050

骨質(zhì)疏松癥是一種普遍隨年齡增長而形成的骨和礦物質(zhì)紊亂的疾?。?］，骨質(zhì)疏松癥由峰值骨量和年齡增長相關(guān)的骨丟失兩方面決定［2］。峰值骨量是骨成熟末期達(dá)到的最大骨量，是骨最堅硬和骨礦含量最高的時期［3］，更高峰值骨量會減緩發(fā)病的概率［4］。因此，提高峰值骨量是一條預(yù)防骨質(zhì)疏松的理想途徑。Bhargavan等［5］報道，通過口服美迪紫檀素提高峰值骨量可達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的目的。淫羊藿具有強筋健骨之功效，常用于治療骨質(zhì)疏松或促進(jìn)骨折愈合［6］。淫羊藿苷 (icariin，ICA)是淫羊藿中含量最為豐富的黃酮苷類化合物，金雀異黃酮是豆科植物中的一種異黃酮，是近年較受關(guān)注抗骨質(zhì)疏松新藥［7］。ICA比金雀異黃酮 (genistein，GEN)在8位碳上多1個異戊烯基，有研究表明，ICA比GEN能更強地促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨性分化和礦化成熟［8］。本研究通過口服 ICA與GEN，探討其對大鼠峰值骨密度和骨質(zhì)量的影響，以期對ICA抗骨質(zhì)疏松活性作出初步判斷，并探索其中更強活性的藥物。

材料和方法

材料 1月齡SD雌性大鼠36只，SPF級，體重(125±3)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供 ［合格證號:SCXK(甘)2004-0006-152］;淫羊藿苷、金雀異黃酮購自陜西寶雞辰光生物科技有限公司，純度≥98%;抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒和骨鈣素試劑盒為英國IDS公司產(chǎn)品;Technovit@9100試劑盒為Heraeus Kulzer GmbH＆Co.KG公司產(chǎn)品;雙能X射線骨密度儀 (GE公司，美國)、顯微 CT(Micro-CT，μCT)(MILabs公司，荷蘭)和AG-IS萬能材料實驗機(jī) (島津公司，日本)均為本實驗室儀器。

分組和給藥 實驗大鼠隨機(jī)抽樣法分為3組，每組12只，一組每日灌服淫羊藿苷，稱為服藥組，一組每日灌服金雀異黃酮，稱為陽性對照組，另一組只給予等體積蒸餾水，稱作對照組。淫羊藿苷用蒸餾水配成2.5 g/L的混懸液。按每只大鼠25 mg/kg體重給藥。金雀異黃酮用蒸餾水配成1 g/L的混懸液。按每只大鼠10 mg/kg體重給藥。大鼠飼養(yǎng)于SPF級實驗室，自由攝水和進(jìn)食，記錄每日進(jìn)食量和進(jìn)水量，每周稱1次體重。

臟器常規(guī)病理學(xué) 動物處死后訊即剝離出心臟、肝臟、胃、腎、腎上腺和子宮，稱重，計算器官指數(shù)，并將所有器官固定于10%福爾馬林中，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，由高年資深病理醫(yī)師進(jìn)行病理學(xué)觀察與評價。

骨密度的測定 每月在麻醉狀態(tài)下測1次全身骨密度，第3個月測完后即處死所有動物，剝離出四肢長骨，左側(cè)股骨用于檢測骨密度。麻醉采用10%水合氯醛，劑量為3 ml/kg，腹腔注射。

血清生化指標(biāo)的測定 采用心臟取血法抽取血樣，4000 r/min離心10 min(轉(zhuǎn)子半徑為10 cm)，取上層血清，－80℃保存;按試劑盒說明書制作骨鈣素(osteocalcin，OC)和抗酒石酸性磷酸酶5b(anti-tartaric acid phosphatase 5b，TRACP 5b)標(biāo)準(zhǔn)曲線，OC于450 nm、TRACP 5b于405 nm處測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出含量。

μCT影像分析 將右側(cè)股骨用70%酒精固定。感興趣區(qū)域選擇在距生長板1 mm位置。分析參數(shù)包括相對骨體積率、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度和模型系數(shù)，并采集成像圖片。

骨形態(tài)計量分析 將右側(cè)脛骨固定于70%酒精中。嚴(yán)格按照technovit@9100試劑盒操作說明書依次進(jìn)行脫水、脫塑、浸漬、滲透和包埋，聚合2 d后切片，磨片，用VG法染色，觀察骨骺線下1～4 mm距離區(qū)域。

生物力學(xué)分析 將左側(cè)股骨用浸透0.9%生理鹽水的紗布包裹后保存于－20℃。在實驗24 h前取出，于室溫下自然解凍。3點彎曲實驗的跨距為17 mm，速度為10 mm/min。記錄載荷變形曲線，得到包括最大載荷、屈服強度和彈性模量等指標(biāo)。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件完成，所有檢測數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間差異采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD檢驗法 (方差齊)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

進(jìn)食量、進(jìn)水量和體重 3組大鼠的每日進(jìn)食量和進(jìn)水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，體重雖然有隨時間增長而增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(圖1)。

臟器常規(guī)病理學(xué) 3組心臟、肝臟、胃、腎、腎上腺和子宮的器官指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);且常規(guī)病理學(xué)觀察無異常改變。

骨密度 3組大鼠的全身骨密度在實驗開始時、服藥后1個月和服藥后2個月差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但服藥后3個月差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。股骨骨密度與全身骨密度變化趨勢一致 (表1)。

血清OC和TRACP 5b含量 ICA組大鼠血清OC、PINP水平顯著高于對照組 (P＜0.05，P＜0.01);而血清TRACP 5b、CTX-I水平顯著低于對照組 (P＜0.05，P＜0.01)(表2)。

μCT影像 ICA組相對骨體積率、骨小梁數(shù)和骨小梁厚度明顯高于對照組組 (P＜0.05)，但骨小梁分離度和模型系數(shù)明顯低于對照組組 (P＜0.05)，GEN模型系數(shù)較對照組顯著降低，ICA組與GEN組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)(表3、圖2)。

骨形態(tài)計量分析 脛骨骨形態(tài)計量分析顯示，ICA組骨小梁數(shù)和骨小梁厚度顯著高于對照組與GEN組 (P＜0.05)，但骨小梁分離度顯著低于對照組與GEN組 (P＜0.05)(圖3)。

圖1 大鼠體重的變化Fig 1 The body weight of rats during experiment

表1 不同時間大鼠全身骨密度和股骨骨密度檢測結(jié)果 (n=12，±s，g/cm3)Table 1 Total and femur bone mineral density of rats at different time points(n=12，x-± s，g/cm3)

表1 不同時間大鼠全身骨密度和股骨骨密度檢測結(jié)果 (n=12，±s，g/cm3)Table 1 Total and femur bone mineral density of rats at different time points(n=12，x-± s，g/cm3)

TBMD-M0:開始服藥前全身骨密度;TBMD-M1:服藥1個月后全身骨密度;TBMD-M2:服藥2個月后全身骨密度;TBMD-M3:服藥3個月后全身骨密度;FBMD-M3:服藥3個月后股骨骨密度;與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與GEN組比較，cP＜0.05TBMD-M0:basal total bone mineral density;TBMD-M1:total bone mineral density after experiment 1 month;TBMD-M2:total bone mineral density after experiment 2 month;TBMD-M3:total bone mineral density after experiment 3 month;FBMD-M3:femur bone mineral density after experiment 3 month;aP ＜0.05，bP＜0.01 compared with control group;cP＜0.05 compared with GEN group

組別Group TBMD-M0 TBMD-M1 TBMD-M2 TBMD-M3 FBMD-M3對照組Control group 0.112±0.006 0.140±0.007 0.151 14 0.151±0.015 0.146±0.010±0.008 0.148±0.01 0.144±0.006 ICA組ICA group 0.111±0.006 0.144±0.007 0.153±0.009 0.160±0.01ac 0.154±0.009bc GEN組GEN group 0.112±0.006 0.143±0.012 0.147±0.0

表2 大鼠血清OC和TRACP 5b的含量 (n=12，±s)Table 2 Serum OC and TRACP 5b of rats(n=12，±s)

表2 大鼠血清OC和TRACP 5b的含量 (n=12，±s)Table 2 Serum OC and TRACP 5b of rats(n=12，±s)

OC:骨鈣素;TRACP 5b:抗酒石酸性磷酸酶5b;PINP:Ⅰ型前膠原氨基端前肽;CTX-Ⅰ:Ⅰ型膠原C末端肽;與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01 OC:osteocalcin;TRACP 5b:anti-tartaric acid phosphatase 5b;PINP:N-terminal propeptide of typeⅠ procollagen;CTX-Ⅰ:C-terminal propeptide of typeⅠcollagen;aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

組別Group OC(ng/ml)TRACP 5b(U/L)PINP(pg/ml)CTX-I(pg/ml)對照組 Control group 0.07279±0.00155 0.73±0.18 0.0±0.00005 0.02120±0.00005 3716±0.00001 0.02324±0.00003 ICA組ICA group 0.07491±0.00134a 0.59±0.08a 0.03922±0.00004b 0.02116±0.00007b GEN組GEN group 0.07447±0.00188 0.71±0.18 0.03921

表3 大鼠股骨顯微CT分析結(jié)果 (n=5，±s)Table 3 Femurs of rats as analyzed by micro-CT(n=5，±s)

表3 大鼠股骨顯微CT分析結(jié)果 (n=5，±s)Table 3 Femurs of rats as analyzed by micro-CT(n=5，±s)

與對照組組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

組別Group模型系數(shù)Structural model index對照組 Control group 31.898± 1.486 2.419±0.091 0.13相對骨體積率Bone volume/tissue volume(%)骨小梁數(shù)量Trabecular number(/mm)骨小梁厚度Trabecular thickness(mm)骨小梁分離度Trabecular spacing(mm)2±0.001 0.433±0.084 0.920±0.190 ICA組ICA group 45.263± 6.060a 3.012±0.173b 0.152±0.010a 0.249±0.045a 0.347±0.233b GEN組GEN group 43.948±11.337 2.807±0.283 0.151±0.025 0.388±0.153 0.365±0.219a

圖2 大鼠股骨顯微CT影像Fig 2 Three-dimensional reconstruction of the femur micro-CT

圖3 大鼠股骨骨形態(tài)圖片 (×40)Fig 3 Bone histomorphometry in rat(×40)

骨生物力學(xué) 股骨三點彎曲實驗顯示，ICA組的最大載荷和彈性模量顯著高于對照組 (P＜0.01)，GEN組的最大載荷顯著高于對照組 (P＜0.05)，ICA組與GEN組的屈服強度均顯著高于對照組(P＜0.05)(表4)。

表4 大鼠骨生物力學(xué)結(jié)果 (n=12，±s)Table 4 Biomechanics of the femurs of rats(n=12，±s)

表4 大鼠骨生物力學(xué)結(jié)果 (n=12，±s)Table 4 Biomechanics of the femurs of rats(n=12，±s)

與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

組別Group最大載荷Maximum load(N)彈性模量Youg’s modulus(mPa)屈服強度Yield load(N)對照組Control group 125.0±17.7 1526.2±247.3 114.2±14.5 ICA組ICA group 156.2±14.3b 2288.5±305.8b 138.2±30.4a GEN組GEN group 144.1±19.3a 2001.0±648.9 136.6±23.9a

討 論

峰值骨量與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，高峰值骨量人群患骨質(zhì)疏松癥的概率相對較低峰值骨量者低，所以獲得高水平的峰值骨量是潛在預(yù)防骨質(zhì)疏松的方法。近年眾多學(xué)者采用剛斷乳后1個月齡雌性大鼠作為實驗動物，通過研究峰值骨量探尋解決骨質(zhì)疏松的途徑。

GEN是一種較為公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，本研究參考選擇該藥物濃度10 mg/kg體重［9］，并換算成同樣摩爾濃度的ICA，即25 mg/kg劑量，在給藥的分子量一致的前提下，對比研究兩種藥物的藥效。在口服ICA與GEN 3個月后，大鼠飲食無變化，未產(chǎn)生毒副作用。與對照組和GEN組相比，ICA顯著提高了全身骨密度與股骨骨密度，而服藥3個月的時間與大鼠骨重建周期需3個月是一致的［10］，表明ICA影響骨密度的能力強于GEN。骨質(zhì)量主要與骨組織微結(jié)構(gòu)有關(guān)，而μCT可以準(zhǔn)確并直觀反映骨微結(jié)構(gòu)和形態(tài)［11］。本研究μCT檢測顯示，ICA能提高骨小梁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)度，從而使大鼠骨質(zhì)緊密，明顯改善骨微結(jié)構(gòu)，而GEN出現(xiàn)提高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。骨生物力學(xué)參數(shù)可較直接地反映骨的抗骨折能力，代表骨硬度?？诜蘒CA與GEN后均顯著提高了大鼠的生物力學(xué)性能，即抗骨折的能力，GEN組生物力學(xué)能力的提高可能是骨組織微結(jié)構(gòu)的改善，但I(xiàn)CA提高骨生物力學(xué)能力的值均高于GEN。通過提高體內(nèi)骨形成水平和抑制骨吸收水平，可以提高骨量。血清骨鈣素、Ⅰ型前膠原氨基端前肽是成骨細(xì)胞分泌的酶，是骨形成的特異性指標(biāo)，抗酒石酸性磷酸酶5b、Ⅰ型膠原C末端肽是破骨細(xì)胞分泌的酶，是骨吸收的特異性指標(biāo)。在血清骨鈣素、抗酒石酸性磷酸酶5b、Ⅰ型前膠原氨基端前肽和Ⅰ型膠原C末端肽的檢測中顯示，ICA組大鼠體內(nèi)骨形成的水平提高，同時骨吸收的水平下降，而GEN未提高骨形成抑制骨吸收，這可能是ICA組大鼠骨密度高于GEN的主要原因。

口服淫羊藿苷與金雀異黃酮3個月后對比研究顯示，淫羊藿苷提高骨密度的能力強于金雀異黃酮，而且對骨硬度的提高能力具有同樣的表現(xiàn)。其原因是淫羊藿苷提高骨形成抑制骨吸收的能力強于金雀異黃酮，而且金雀異黃酮對骨組織微結(jié)構(gòu)的改建弱于淫羊藿苷，導(dǎo)致骨質(zhì)量與骨強度的差異;淫羊藿苷結(jié)構(gòu)帶有的8-異戊烯基可能也是造成淫羊藿苷具有更強活性的原因。但8-異戊烯基基團(tuán)與骨質(zhì)疏松的關(guān)系尚待進(jìn)一步深究。

［1］Okano T.Effects of essential trace elements on bone turnoverin relation to the osteoporosis［J］.Jpn J Clin Med，1996，54(1):148.

［2］安珍，程靜，王文志，等.峰值骨量與骨質(zhì)疏松癥 ［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2001，5(2):152-154.

［3］Mardon J，Mathey J，Kati-Coulibaly S，et al.Influence of lifelong soy isoflavones consumption on bone mass in the rat［J］.Exp Biol Med，2008，233(2):229-237.

［4］Kaludjerovic J，Ward WE.Neonatal exposure to daidzein，genistein，or the combination modulates bone development in female CD-1 mice ［J］.J Nutr，2009，139(3):467-473.

［5］Bhargavan B，Singh D，Gautam AK，et al.Medicarpin，a legume phytoalexin，stimulates osteoblast differentiation and promotes peak bone mass achievement in rats:evidence for estrogen receptor β-mediated osteogenic action of medicarpin［J］.J Nutr Biochem，2012，23(1):27-38.

［6］董遠(yuǎn)芳.淫羊藿等中藥治療骨質(zhì)疏松癥的臨床觀察 ［J］.中藥材，2004，27(8):620-622.

［7］Setchell KD，Lydeking-Olsen E.Dietary phytoestrogens and their effect on bone:evidence from in vitro and in vivo，human observational，and dietary intervention studies［J］.Am J Clin Nutr，2003，78(3):593S-609S.

［8］Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al.Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro ［J］.J Cell Biochem，2011，112(3):916-923.

［9］Elmarakby AA，Ibrahim AS，F(xiàn)aulkner J，et al.Tyrosine kinase inhibitor，genistein，reduces renal inflammation and injury in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.Vasc Pharmacol，2011，55(5):149-156.

［10］Martin TJ，Seeman E.Bone remodelling:its local regulation and the emergence of bone fragility［J］.Res Clin Endcrinol Metab，2008，22(5):701-722.

［11］Liu ZG，Zhang R，Li C，et al.The osteoprotective effect of Radix Dipsaci extract in ovariectomized rats［J］.J Ethnopharmacology，2009，123(1):74-81.