西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（西安710061） 李 琛 于 良

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，病死率高，預(yù)后極差。肝癌在全球發(fā)病率呈逐步上升趨勢，但目前臨床尚無有效治療藥物。研究表明［1］，長期服用非甾體類抗炎藥物可降低消化道惡性腫瘤的發(fā)生率。本研究觀察塞來昔布對肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡及COX-2、VEGF和ERK1／2表達(dá)的影響，并探討該作用與ERK1／2信號通路之間的關(guān)系，為其用于肝癌的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 試劑和儀器 主要試劑：人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購自第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞所；塞來昔布購自美國希爾大藥廠；新生胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜（DMSO）、四氮噻唑鹽（MTT）、胰蛋白酶、瓊脂糖均購自美國Sigma公司；雙抗購自山東魯抗制藥公司；兔抗人COX-2、ERK1／2多克隆抗體、羊抗人VEGF多克隆抗體購自SantaCruz公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒TaKa-Ra公司；PCR引物由上海生工公司合成。主要儀器：實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀購自美國 MJ公司；YCP-200CO2培養(yǎng)箱購自上海易亮醫(yī)療器械有限公司；電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀（ELX800）購自美國BioTek公司；流式細(xì)胞儀購自BD公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721置于含有10%的胎牛血清、100U／ml青霉素及100U／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長，待細(xì)胞鋪滿瓶底的80%時進(jìn)行傳代。實驗選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

3 細(xì)胞生長抑制實驗 采用MTT比色法。SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24h后加無血清培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24h，換含塞來昔布的培養(yǎng)液，終濃度分別為0、25、50、75和100μmol／L，0μmol／L組為對照組。每濃度4個復(fù)孔。分別在加藥后24、48和72h后，避光下加入新配制的 20μl MTT（5mg／ml），置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），10min后酶標(biāo)儀測490nm處吸光度（A）值，根據(jù)公式計算細(xì)胞生長抑制率（IR）。IR的計算公式為：IR（%）=（對照組A值-實驗組A值）／對照組A值×100%。以上實驗均重復(fù)3次。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，倒掉舊的培養(yǎng)液。設(shè)對照組與實驗組共5個組別。孵箱內(nèi)細(xì)胞培育48h后終止培養(yǎng)，胰酶消化后分別制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整待測細(xì)胞密度為5×105個／ml后上機(jī)檢測。

5 RT-PCR檢測SMMC-7721細(xì)胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，按照5×105／孔接種于6孔板中，24h待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度塞來昔布，不加入藥物的孔為對照組。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA，GAPDH 為內(nèi)參。各自引物序列分別是：COX-2F：5’-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3’R：5’-CATTCCTACCACCAGCAACC-3’，ERK1／2 F：5’-GGCTTTCTGACCGAGTATGTG-3’，R：5’-GGGTGTCTGTTCTTGTT AGGG-3’，VEGF F：5’-CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA CC-3’R：5’-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3’，GAPDH F：5’-TCATCCCTGCCTCTACTG-3’R：5’-TGCTTCACCACCTTCTTG-3’。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，退火溫度56℃30s，72℃延伸40s，上述3步驟進(jìn)行30個循環(huán)后，再94℃ 繼續(xù)延伸5min，置4℃ 保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照用Quantity One軟件對照片進(jìn)行灰度值掃描，以目的條帶與其相應(yīng)內(nèi)參GAPDH的光密度比代表目的基因mRNA的相對水平，實驗重復(fù)3次。

6 Western blot法檢測 COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。BCA法測蛋白濃度后，取40ug蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1h后加入抗體孵育過夜。次日TBST洗膜后加入二抗，室溫1h后TBST洗膜3次。ECL浸泡后X片曝光，分析結(jié)果。所用內(nèi)參為GAPDH。

7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 見附表。不同濃度塞來昔布處理SMMC-7721細(xì)胞24、48、72h后，用MTT法測定細(xì)胞增殖，與對照組相比，各實驗組A值均有所降低，其中100μmol／L組A值降低更為明顯；抑制率隨藥物濃度增高、作用時間的延長而增高，同一時間點不同濃度組的抑制率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明塞來昔布能有效抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈時間和劑量依賴性。

附表 細(xì)胞生長抑制試驗結(jié)果

2 塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響見圖1。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，25、50、75和100μmol／L塞來昔布孵育SMMC-7721細(xì)胞后出現(xiàn)了明顯的凋亡，各實驗組的凋亡率與對照組相比，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同濃度塞來昔布處理后各組細(xì)胞凋亡率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率隨著塞來昔布濃度的增加而增加。

圖1 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響

3 塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表達(dá)的影響 見圖2。不同濃度的塞來昔布（25、50、75和100μmol／L）作用于SMMC-7721細(xì)胞24h后，與對照組相比，COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨塞來昔布濃度的增加，三者的表達(dá)均呈逐漸下調(diào)趨勢。

圖2 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表達(dá)的影響

4 塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達(dá)的影響 見圖3。Western blot結(jié)果顯示，實驗組與對照組比較COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同濃度塞來昔布組之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達(dá)的影響

討 論

肝癌是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，但缺乏有效防治藥物。臨床肝癌化療藥物的有效率均不足20%，因此，尋找高效低毒的藥物成為肝癌治療的熱點。塞來昔布是近年來出現(xiàn)的特異性COX-2抑制劑，Harris等［2］發(fā)現(xiàn)其具有預(yù)防乳腺癌發(fā)生的作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布對胃癌、結(jié)腸癌、膽管癌、白血病、膀胱癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞均有抑制生長和促進(jìn)凋亡的作用［3-4］。在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中，MAPK信號通路起著重要作用，其中ERK1／2信號途徑具有重要地位。ERK1／2對腫瘤的作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，活化的ERK激酶可作用于其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)因子和凋亡分子的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖和向惡性轉(zhuǎn)化。Schuierer等［5］人研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中ERK1／2活性較正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。

本實驗以既往相關(guān)文獻(xiàn)報道塞來昔布能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為依據(jù)，以塞來昔布能否抑制體外培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為切入點，通過觀察塞來昔布對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、凋亡及 COX-2、VEGF和 ERK1／2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討其可能機(jī)制。

本實驗通過不同濃度塞來昔布處理SMMC-7721細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，且呈時間和濃度依賴性。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)不同濃度塞來昔布處理的SMMC-7721細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。這些結(jié)果與國內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)果相一致［6-7］。

本實驗在觀察塞來昔布具有抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的同時，對其機(jī)制作了進(jìn)一步的探討。目前，COX-2抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩個方面，即COX-2依賴性途徑和非COX-2依賴性途徑。COX-2依賴性途徑主要包括通過抑制COX-2減少前列腺素合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［8-9］。非COX-2依賴性途徑抗腫瘤機(jī)制目前多家說法不一［10］。本實驗結(jié)果顯示，不同濃度的塞來昔布作用于SMMC-7721細(xì)胞后，其細(xì)胞中ERK1／2和VEGF的表達(dá)均明顯下調(diào)，且呈濃度依賴性，表明其作用機(jī)制可能與ERK1／2信號通路及抑制腫瘤新生血管形成有關(guān)。

綜上所述，本實驗證實了塞來昔布具有抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，為臨床上治療肝癌提供了新的思路。同時揭示塞來昔布抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制除了與抑制COX-2的活性相關(guān)外，還可能與下調(diào)ERK1／2信號通路及抑制腫瘤新生血管形成有關(guān)，但具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

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