李不學(xué)，杜 軍，郭啟航，孫敬禮, 李志遠(yuǎn)*

（1．新疆軍區(qū)農(nóng)業(yè)新技術(shù)試驗(yàn)培訓(xùn)基地，新疆 石河子 832023；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000）

母豬的生產(chǎn)效率是養(yǎng)豬業(yè)總體經(jīng)濟(jì)效益獲得提高的關(guān)鍵,而產(chǎn)仔性能的高低直接影響母豬的生產(chǎn)效率,因此,產(chǎn)仔數(shù)這一重要經(jīng)濟(jì)性狀一直倍受養(yǎng)豬者和育種專家的重視。豬繁殖性狀的遺傳力很低, 只有0.1 左右,又屬限性性狀,通過常規(guī)育種方法對豬繁殖性狀進(jìn)行遺傳改良進(jìn)展緩慢。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,從分子水平探討影響豬繁殖性能的機(jī)制成為可能,為種豬的遺傳改良提供了新的機(jī)遇。

骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的分泌型糖基化磷蛋白,廣泛存在于乳汁、子宮、胎盤等組織和體液中,具有多種生物學(xué)活性[1]。OPN 是子宮一胎盤微環(huán)境的重要組成部分，幾乎參與了生殖的全過程，包括受精、胚泡著床及胎盤形成等。鑒于其在動(dòng)物繁殖中的重要功能,近年來它成為豬繁殖性狀的重要候選基因之一[2]。本實(shí)驗(yàn)檢測了長白豬OPN基因多態(tài)性并分析了其與遺傳性狀的關(guān)系,為選種、育種、提高豬的繁殖性能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)材料取自于農(nóng)八師142 團(tuán)牧二隊(duì)四豬場，采集長白母豬耳組織樣置于已高壓滅菌的1.5 mL 離心管中，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存。

1.2 DNA 提取

采用傳統(tǒng)苯酚-氯仿-異戊醇法提取DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

所用引物參照Knoll 等[2]報(bào)道的序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。F:5′-TCACCGATTTCCCCACCGACAC-3′；R: 5′-TGGCTGCGGGTTTCC ACACTG-3′。

1.4 PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)體系: 0.2 mmol dNTP，2.0μmol 特 異 引 物，1 Unit Taq 聚合 酶,1.5 mmol Mg2+, 300～500 ng cDNA 模 板,1×buffer 2.5μL, 加 超 純水至總體積25μL。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件:94 ℃變性4 min, 35 次 循 環(huán)(94 ℃,40 s；60 ℃,1 min；72 ℃,70 s),72 ℃延 伸10 min。

1.5 多態(tài)性檢測

OPN 基 因 由 片 段 插 入 造成, PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測即可見多態(tài)性, 在凝膠上顯示為3 種帶型: 1295 bp、1295 bp/990 bp 和990 bp,分別為AA、AB 和BB 型。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。產(chǎn)仔數(shù)在各基因型間的差異顯著性，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用于分析的統(tǒng)計(jì)模型為:yi=μ+αi+ei；其 中yi為 性 狀值,μ為總體平均數(shù),αi為基因型效應(yīng)值(i=AA,AB,BB),ei為隨機(jī)誤差[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因分型

使用特異性引物對長白豬DNA 樣進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增,PCR 擴(kuò)增所得目的帶出現(xiàn)了3 種帶型(圖1),與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 基因型頻率和基因頻率

根據(jù)OPN 基因型檢出個(gè)數(shù)，計(jì)算基因型頻率和基因頻率，見表1。OPN基因在長白豬中的優(yōu)勢基因?yàn)锽 等位基因；BB 基因型頻率最大,AA 基因型頻率最小,AB 基因型頻率在兩者之間。

2.3 基因型與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性分析

由于初產(chǎn)母豬的樣本數(shù)太少，且沒出現(xiàn)AB 型個(gè)體，這里就不分析初產(chǎn)母豬基因型之間的差異性。從表2 可以看出, OPN 基因多態(tài)性與經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)仔活數(shù)有相關(guān)性，呈AA ＞AB ＞BB 趨勢，其中經(jīng)產(chǎn)母豬和試驗(yàn)豬所有胎次AA 型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于BB 和AB 型個(gè)體（P＜0.05）。

表1 OPN 基因基因型頻率及基因頻率

表2 OPN 基因?qū)﹂L白豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的影響

3 討論

OPN 基因的多態(tài)性非常豐富, 孟慶利和劉鐵錚(2005)在二花臉豬和蘇鐘豬上檢測到多個(gè)等位基因與產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)[4]。Knoll 等[2]研究發(fā)現(xiàn)豬OPN基因的第6 內(nèi)含子上有305 bp 的缺失,并發(fā)現(xiàn)長白豬、皮特蘭豬上A 等位基因占優(yōu)勢(0.57 和0.82), 而大白豬和杜洛克豬的B 等位基因占優(yōu)勢 (0.74 和0.84)。羅仍卓么[5]報(bào)告在長白豬中B等位基因頻率最大，為0.770 8。本實(shí)驗(yàn)長白豬群體中A 和B 等位基因均有分布,且B 等位基因占優(yōu)勢,與羅仍卓么的結(jié)果類似，但不同于Knoll 的結(jié)果。在OPN 基因第6 內(nèi)含子305 bp 的缺失突變上,Korwin-Kossakowska 等[6]對990 頭合成系母豬進(jìn)行了研究,結(jié)果表明在TNB、NBA、21 日齡仔豬數(shù)、斷奶仔豬數(shù)、21 日齡窩重和斷奶窩重等性狀上，AA 型經(jīng)產(chǎn)母豬個(gè)體均顯著高于AB 和BB 型個(gè)體(P<0.05),但對初產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔性能無顯著影響。羅仍卓么[5]研究認(rèn)為OPN 基因在長白豬初產(chǎn)母豬中 AA 型個(gè)體的 NBA 和 TNB 顯著的高于 AB 和BB 型個(gè)體(P<0.05),而在經(jīng)產(chǎn)母豬群體中,AB 型比BB 型個(gè)體的 TNB 和 NBA 分別多 1.92 頭和1.98 頭(P<0.05)。孫敬禮等[7]在長大雜種母豬中的發(fā)現(xiàn)OPN 不同基因型母豬產(chǎn)仔數(shù)呈現(xiàn)出BB ＞AB ＞AA 的趨勢。本研究結(jié)果表明: OPN 基因在長白豬經(jīng)產(chǎn)母豬和母豬所有胎次的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)性狀均呈AA ＞AB ＞BB 趨勢，其中經(jīng)產(chǎn)母豬和所有胎次母豬AA 型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔活數(shù)顯著高于AB 和BB 型個(gè)體（P＜0.05），與Korwin-Kossakowska 等[6]的結(jié)果類似。

AA 基因型可能是長白豬的高產(chǎn)基因型，在更大規(guī)模的群體中驗(yàn)證后，方可在隨后的育種生產(chǎn)實(shí)踐中，根據(jù)基因檢測結(jié)果，結(jié)合產(chǎn)仔記錄和生產(chǎn)性能，選擇OPN AA 基因型的豬留種，以加快產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳進(jìn)展，提高生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益。

[1] 黃仕和,等.骨橋蛋白的生物學(xué)功能[J].生命的化學(xué),2001,21(5):389-391.

[2] Knoll A,Stratil A,Cepica S and Dvorak J.Length polymorphism in an intron of the porcine osteopontin(SPP1) gene is caused by the presence or absence of a SINE(PRE-1) element[J].Animal Genetics,1999,30(6):462-478.

[3] 徐寧迎,章勝喬,彭淑紅.金華豬3 個(gè)繁殖性狀主基因的分布及其效應(yīng)的研究[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(12):1090-1096.

[4] 孟慶利，劉鐵錚.豬骨調(diào)素基因多態(tài)性對產(chǎn)仔性狀的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2005，26(3）：13-16.

[5] 羅仍卓么，王立賢，孫世鐸.豬OPN 基因與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].農(nóng)業(yè)生物科技學(xué)報(bào),2008,16(3):412-416.

[6] Korwin-Kossakowska A, Kamyczek M, Cieslak D, et al. The effect of the polymorphism of leptin(LEP),l e p t i n r e c e p t o r(L E P R) a n d osteopontin(OPN) genes on selected reproduction traits of synthetic Line 990 Sows[J].Anim Sci Pap Rep,2002,20:159-168.

[7] 孫 敬 禮， 武 磊， 黃 濤, 等.OPN 和BMP15 基因與大長雜交一代母豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系[J].豬業(yè)科學(xué)，2010，27（4）：90-92.