李曉 閔蘇 李煒 羅潔 魏珂 黎平 劉小濱

細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)屬于脯氨酸限定性絲/蘇氨酸細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶的家族成員，受激活蛋白p35、p39、p25、p29的調(diào)節(jié)，近年來研究證實其在突觸傳遞中發(fā)揮著重要的作用，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切[1,2]?？ㄅ湟?I（calpain I）可將 p35 蛋白裂解為p25，p25較p35更穩(wěn)定，與Cdk5結(jié)合后使其活性明顯增強(qiáng)[2,3]，Zhu等[4]發(fā)現(xiàn)在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠模型中Cdk5激酶活性增高。電休克治療(Electroconvulsive therapy，ECT)是重癥抑郁癥的一種有效治療手段，但可引起嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶損害[5]，而異丙酚聯(lián)合電休克能夠顯著減輕ECT引起的學(xué)習(xí)記憶損害[6,7]，但是引起這種保護(hù)的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬通過觀察觀察異丙酚聯(lián)合電休克對抑郁大鼠中海馬calpain I-Cdk5通路的影響，探討異丙酚改善電休克治療抑郁大鼠致學(xué)習(xí)記憶損害的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及建模 健康成年雄性SD大鼠50只(由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，2～3月齡，體重180～220g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組（n=10）：抑郁模型組、異丙酚組、電休克組、異丙酚聯(lián)合電休克組（簡稱聯(lián)合組）、正常對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制備和各組的處理 前4組大鼠參照文獻(xiàn)[8,9]采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激建立抑郁模型。模型建立成功后，電休克組腹腔注射生理鹽水8 mL/kg后給予ECT治療，ECT采用改良電休克治療儀(Niviqure technique，印度)，參數(shù)設(shè)置為雙相矩形波、波幅0.8A、波寬 1.5ms、125 脈沖/s，以引起強(qiáng)直-陣攣抽搐發(fā)作為治療成功；聯(lián)合組腹腔注射異丙酚（AstraZeneca，意大利）80mg/kg，待翻正反射消失后給予電休克組相同的電刺激。異丙酚組腹腔注射異丙酚80 mg/kg，抑郁模型組和正常對照組腹腔注射生理鹽水8 ml/kg,雙耳夾電極但不給予電刺激。以上處理每天1次，連續(xù)7d，藥物劑量選擇和處理方法參照本課題組的前期研究[10]。

1.2.2 行為學(xué)評定和學(xué)習(xí)記憶功能檢測 建模前、建模后及治療后參照文獻(xiàn)[7,11]分別采用open-field實驗評價抑郁狀態(tài)和Morris水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶功能。Open-field實驗結(jié)果以運動活動距離和直立次數(shù)表示。Morris水迷宮實驗以逃避潛伏期和空間探索時間來表示。逃避潛伏期越短說明學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)，空間探索時間越短表示記憶成績越差。

1.2.3 樣本制備 各組隨機(jī)選取5只大鼠用0.5%戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后4%多聚甲醛灌流內(nèi)固定，切取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織作免疫組化。各組剩余大鼠麻醉后快速斷頭，分離雙側(cè)海馬，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測calpain I蛋白的表達(dá)采用SABC法檢測calpain I蛋白的表達(dá)，DAB法顯色，PBS液代替一抗calpain I(北京博奧森生物科技)作為陰性對照。每張切片取5個視野，顯微鏡（Olympus，日本）下觀察照相。以Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析海馬CA1和CA3區(qū)陽性表達(dá)區(qū)的光密度平均值（mean optical density，MOD）。

1.2.5 Western blot法檢測Cdk5蛋白的表達(dá) 用細(xì)胞裂解液將研磨后的左側(cè)海馬組織溶解，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下放入含脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，將封閉后的膜加入一抗Cdk5（Santa Cruz)，4℃孵育過夜。加入辣根氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)1h，ECL顯影。采用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)蛋白Cdk5和內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.2.6 液閃法檢測Cdk5的活性 用細(xì)胞裂解液將研磨后的左側(cè)海馬組織溶解，加入Cdk5孵育過夜，再加入A-Sepharose使免疫復(fù)合物沉淀，離心后用清洗緩沖液將免疫復(fù)合物清洗3次，去除上清液。收集到的免疫復(fù)合物加入Cdk5緩沖液（其中包括2μg組蛋白H1和 5μCi的32P 標(biāo)記的γ-ATP溶液），反應(yīng)終體積為50 μl。在30℃環(huán)境下孵育30min，在濾紙上風(fēng)干脫水，最后用液體閃爍計數(shù)器測定產(chǎn)物的CPM值，用該值反應(yīng)Cdk5活性的大小，該值越大表明Cdk5的活性越高。

1.2.7 RT-PCR法檢測calpainⅠ和Cdk5 mRNA的表達(dá) 引物根據(jù)GenBank提供的模板，由上海鼎安生物技術(shù)有限公司合成。按Trizol試劑說明提取右側(cè)海馬總RNA，反應(yīng)體系成分和條件設(shè)定均參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外透射燈下觀察拍照。用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Quantity One系統(tǒng))分析PCR電泳結(jié)果，結(jié)果以目的基因與GAPDH吸光度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0進(jìn)行分析，計量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用方差分析和q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠open-field評分比較 建模前，各組間水平活動距離和直立次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；建模后，與正常對照組比較，其余4組水平活動距離和直立次數(shù)減少（F=27.56,P＜0.01;F=42.56,P＜0.01）；治療后，與正常對照組比較，其余4組水平活動距離和直立次數(shù)減少，與抑郁模型組比較，電休克組、聯(lián)合組水平活動距離和直立次數(shù)增加（F=27.82,P＜0.01;F=39.99,P＜0.01），抑郁模型組與異丙酚組之間的水平活動距離和直立次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績比較 建模前，各組間逃避潛伏期及空間探索時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；建模后，與正常對照組比較，其余4組逃避潛伏期延長、空間探索時間縮短（F=8.54,P＜0.01;F=10.34,P＜0.01）;治療后，與正常對照組比較，其余4組逃避潛伏期延長、空間探索時間縮短；與抑郁模型組比較，電休克組逃避潛伏期延長、空間探索時間縮短，抑郁模型組與異丙酚組、聯(lián)合組之間的逃避潛伏期和空間探索時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與電休克組比，聯(lián)合組逃避潛伏期縮短、空間探索時間延長（F=53.23,P＜0.01;F=40.33,P＜0.01）。見表2。

表1 大鼠open-field評分比較（）

表1 大鼠open-field評分比較（）

1)與對照組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.052)與抑郁模型組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.053)與異丙酚組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.05

建模前 建模后 治療后組別n 水平活動距離(cm)直立次數(shù)(次)水平活動距(cm)直立次數(shù)(次)水平活動距離(cm)直立次數(shù)(次)抑郁模型組異丙酚組電休克組異丙酚聯(lián)合電休克組對照組1010101010761.87±114.90753.94±131.96756.51±157.25746.50±119.92741.74±105.9117.60±2.9917.50±3.0618.00±3.5616.90±3.0016.90±2.28316.80±99.381)312.30±97.231)292.33±97.181)309.10±102.541)692.32±120.654.50±2.461)4.90±2.031)4.30±2.981)3.50±2.461)17.30±3.86314.24±102.151)300.69±84.081)506.73±108.911)2)3)507.21±105.201)2)3)726.82±119.234.40±2.321)4.60±1.901)9.90±2.961)2)3)10.70±2.161)2)3)16.90±3.28

表2 大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績比較（）

表2 大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績比較（）

1)與對照組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.052)與抑郁模型組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.053)與異丙酚組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.054)與電休克組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.05

組別抑郁模型組異丙酚組電休克組異丙酚聯(lián)合電休克組對照組n 1010101010建模前逃避潛伏期(s)33.64±4.1734.52±2.9334.57±3.7635.23±3.5734.95±2.75空間探索時間(s)14.10±3.7813.87±4.3314.34±4.1513.41±5.1213.96±3.89建模后逃避潛伏期(s)27.89±4.661)27.08±5.161)27.98±4.331)29.11±4.881)19.11±2.22空間探索時間(s)21.32±5.131)20.92±3.921)22.17±3.961)20.54±3.891)30.83±4.24治療后逃避潛伏期(s)16.67±4.151)17.51±4.351)33.23±3.491)2)3)17.91±4.041)4)8.90±3.00空間探索時間(s)32.39±3.781)32.61±4.151)18.50±3.701)2)3)30.09±3.801)4)40.96±4.60

表3 大鼠海馬calpain I與Cdk5的蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)和Cdk5活性（）

表3 大鼠海馬calpain I與Cdk5的蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)和Cdk5活性（）

1)與對照組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.052)與抑郁模型組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.053)與異丙酚組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.054)與電休克組比較，經(jīng)q檢驗，P＜0.05

calpain I Cdk5組別抑郁模型組異丙酚組電休克組異丙酚聯(lián)合電休克組對照組n 5 5 5 5 5 CA1區(qū)平均光密度值0.13±0.031)0.15±0.041)0.20±0.031)2)3)0.15±0.031)4)0.11±0.03 CA3區(qū)平均光密度值0.17±0.041)0.16±0.031)0.22±0.031)2)3)0.17±0.031)4)0.13±0.03 mRNA相對表達(dá)量0.54±0.021)0.55±0.031)0.82±0.051)2)3)0.58±0.021)4)0.32±0.02蛋白相對表達(dá)量0.50±0.070.49±0.061.13±0.051)2)3)0.76±0.051)2)3)4)0.51±0.03 CPM值3148.42±196.651)3145.95±158.511)5770.24±202.261)2)3)3272.92±137.571)4)1966.92±155.67 mRNA相對表達(dá)量0.37±0.030.35±0.020.63±0.031)2)3)0.46±0.011)2)3)4)0.36±0.02

2.3 各組大鼠海馬內(nèi)calpain I與Cdk5的蛋白和mRNA表達(dá)及Cdk5活性的比較 與正常對照組比較，其余4組calpain I蛋白和mRNA表達(dá)增加、Cdk5活性升高（CA1區(qū)：F=28.97,P＜0.01,CA3區(qū)：F=28.25,P＜0.01;F=160.08,P＜0.01;F=329.58,P＜0.01），僅電休克組、聯(lián)合組Cdk5蛋白和mRNA表達(dá)增加（F=139.40,P＜0.01;F=126.51,P＜0.01）；與抑郁模型組比較，電休克組calpain I和Cdk5蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均增加、Cdk5活性升高，聯(lián)合組Cdk5蛋白和mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）；與電休克組比較，聯(lián)合組calpain I和Cdk5蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)減少，Cdk5活性降低（P＜0.05）。見表3，圖1、2、3。

3 討論

慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)方法建立抑郁模型廣泛應(yīng)用于抑郁癥機(jī)制的研究，能夠有效的模擬人類環(huán)境應(yīng)激所導(dǎo)致的抑郁癥[12]。Open-field實驗可以反映動物在新環(huán)境中的探索能力和興奮程度，能輔助評定動物的抑郁狀態(tài)。Morris水迷宮是評價動物學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法，主要反映動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。本實驗的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建模后大鼠的open-field評分明顯下降，提示抑郁模型是建立成功的；治療后，電休克組和聯(lián)合組對新環(huán)境的探索能力和興奮程度得到了明顯改善，說明單純電休克和異丙酚聯(lián)合電休克都可以有效地緩解抑郁癥狀，而異丙酚組大鼠行為學(xué)和抑郁模型組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明單純異丙酚對抑郁大鼠沒有治療作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)電休克組大鼠的逃避潛伏期比聯(lián)合組延長，空間探索時間縮短，而抑郁模型組、異丙酚組和聯(lián)合組的逃避潛伏期和空間探索時間無差異，表明單純電休克處理引起了抑郁大鼠學(xué)習(xí)記憶的損害，而異丙酚可以減輕單純電休克處理對抑郁大鼠學(xué)習(xí)記憶的損害，這與本課題組的前期研究是一致的[6,7]。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)（A1-E1)和CA3區(qū)(A2-E2)CalpainⅠ的表達(dá)（SABC法免疫組化染色，DAB顯色，標(biāo)尺50μm）A:對照組；B:抑郁組；C:單純異丙酚組；D:單純電休克組；E:異丙酚聯(lián)合電休克組

圖2 大鼠海馬Cdk5蛋白的表達(dá)（Western-blot法）

Cdk5高表達(dá)于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是海馬的錐體細(xì)胞和皮層神經(jīng)元等一些大神經(jīng)元，單體Cdk5無活性，它的激活依賴于激活蛋白p35和p39[13]。研究表明，在一些刺激因素如炎癥、氧化應(yīng)激和興奮性毒性刺激促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加的情況下，二者可被calpain裂解為半衰期更長的p25和p29[14]，使Cdk5的活性增加。本研究發(fā)現(xiàn)，與抑郁模型組比較，電休克組大鼠海馬calpain I和Cdk5蛋白及mRNA表達(dá)增加、Cdk5活性升高，提示電刺激可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，進(jìn)而導(dǎo)致上述指標(biāo)變化。

目前的研究認(rèn)為，LTP是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)，其產(chǎn)生主要依賴于海馬NMDA-NR2B受體的激活[15]。Hawasli等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，Cdk5 可通過與NMDA受體亞基的相互作用影響NR2A的磷酸化或NR2B在細(xì)胞膜上的表達(dá)。也有研究表明，抑制Cdk5的活性后通過Src激酶與PSD-95的結(jié)合可增加NMDA受體NR2B亞基第1472位酪氨酸的磷酸化，從而減少NR2B亞基的內(nèi)吞，增加其在細(xì)胞膜上的表達(dá)[17]。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)的電刺激可導(dǎo)致Cdk5基因的表達(dá)上調(diào)[18]。本研究中單純的電休克處理不僅增加了calpain I和Cdk5的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)，同時使Cdk5的活性顯著升高，雖然有效緩解了大鼠的抑郁狀態(tài)，使大鼠的行為學(xué)指標(biāo)得到了明顯改善，但是其引起的興奮性神經(jīng)毒性作用可能造成了鈣離子的內(nèi)流，活化calpain I和Cdk5，最終使海馬LTP上調(diào)至飽和狀態(tài)，造成學(xué)習(xí)記憶的嚴(yán)重?fù)p害[19]。

在本研究中，異丙酚聯(lián)合電休克處理抑郁大鼠后發(fā)現(xiàn)，與電休克組比較，calpain I和Cdk5的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)減少，Cdk5活性降低，提示異丙酚抑制了calpain I和Cdk5蛋白表達(dá)。Hans等研究認(rèn)為異丙酚能夠減弱NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性與其抑制了谷氨酸觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加有關(guān)[20]，這可能是異丙酚聯(lián)合電休克后使calpain I和Cdk5向正常方向變化的原因。

結(jié)合本研究的結(jié)果，單純的電休克處理會導(dǎo)致大鼠海馬calpain I-Cdk5通路上calpain I和Cdk5的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)增加、Cdk5活性升高，這些表達(dá)的異?？勺罱K影響LTP，造成突觸可塑性的變化，引起學(xué)習(xí)記憶損害。異丙酚減輕大鼠電休克處理后學(xué)習(xí)記憶損害，可能與其在一定程度上抑制了calpain I和Cdk5的表達(dá)及Cdk5的活性有關(guān)。本實驗中在研究calpain I-Cdk5通路時未采用calpain I抑制劑來進(jìn)一步驗證此通路，存在一定的局限性。綜上所述，異丙酚減輕抑郁大鼠電休克處理后學(xué)習(xí)記憶損害，其機(jī)制可能與異丙酚降低了電休克處理后calpain I-Cdk5通路的表達(dá)有關(guān)。

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