EPO光激化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法的建立①

陳 凱 吳 丹 聶慶東 相 平 任 杰 李會(huì)強(qiáng)

(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫學(xué)教研室，天津300140)

促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種調(diào)控紅細(xì)胞生成的糖蛋白激素，主要由腎臟近曲小管附近的細(xì)胞合成和分泌，能刺激骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放，從而調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞存活、增殖、分化及成熟的造血因子，具有維持外周血中紅細(xì)胞、血紅蛋白恒定的作用，血液中EPO的水平能反映機(jī)體紅細(xì)胞生成的能力。因此測(cè)定血液病貧血患者血清中EPO水平，對(duì)了解各類貧血的發(fā)病機(jī)制有一定價(jià)值，同時(shí)可為患者糾正貧血癥狀提供依據(jù)。目前檢測(cè)EPO的方法有酶聯(lián)免疫、放射免疫及化學(xué)發(fā)光免疫等，作為近年興起的新型定量免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(Light initiated chemiluminescence assay，LiCA)技術(shù)，其具有靈敏度高、時(shí)間分辨能力強(qiáng)、線性范圍寬、背景熒光低、免洗板、性質(zhì)穩(wěn)定、快速簡(jiǎn)便、易于微型化自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，代表了現(xiàn)在及未來(lái)分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。本研究利用發(fā)光微粒和感光微粒兩種核心物質(zhì)的光特性，建立了一種新的快速定量檢測(cè)血漿EPO濃度的雙抗體夾心模式的LiCA方法，并對(duì)該法的重復(fù)性、敏感性、抗干擾性及回收率等指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 陽(yáng)性血清標(biāo)本51例來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，采用由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供的EPO放射免疫分析試劑盒檢測(cè)。100例正常人血清來(lái)源于天津市北辰醫(yī)院身體健康、無(wú)貧血指標(biāo)異常的體檢人群，均經(jīng)過(guò)血常規(guī)檢查，紅細(xì)胞及血紅蛋白均無(wú)異常，其中男性47例，女性53例，年齡22～65歲，平均(44±11)歲，紅細(xì)胞(4.55±0.6)×1012L-1，血紅蛋白(131±20)g/L。

1.1.2 材料和儀器 LiCA通用液[鏈霉親和素(SA)包被的感光微粒]及發(fā)光微粒購(gòu)自上海博陽(yáng)生物有限公司。三株EPO抗體及EPO標(biāo)準(zhǔn)品(30 ng/ml)由天津沃克生物科技有限公司提供。96孔微孔板及LiCA HT熒光檢測(cè)儀為上海博陽(yáng)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 抗體包被發(fā)光微粒 依據(jù)博陽(yáng)7 000系列微球包被程序，通過(guò)發(fā)光微粒懸液處理，抗體透析，混合，反應(yīng)，封閉，清洗幾個(gè)步驟，將抗體共價(jià)結(jié)合于發(fā)光微粒。

1.2.2 抗體與生物素連接 抗體的準(zhǔn)備:將抗體置于0.1 mol/L 緩沖液(0.1 mol/L、Na2CO3/NaHCO3，pH9.5)中充分透析，其間換液數(shù)次，測(cè)抗體濃度，調(diào)濃度至1 mg/ml。按摩爾比5∶1混合生物素和抗體，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)。在4℃下用0.1 mol/L PBS(pH7.4)溶液透析24小時(shí)，其間換液數(shù)次，充分去除未結(jié)合的生物素。

1.2.3 雙抗體夾心模式LiCA檢測(cè)步驟 將25 μl標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)血漿標(biāo)本分別加到相應(yīng)反應(yīng)孔內(nèi)，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定2次;每孔加入25 μl的發(fā)光微?？贵w;每孔加入25 μl的生物素化抗體;把已加好的反應(yīng)板放入LiCA儀中，37℃振動(dòng)孵育30分鐘;每孔加入LiCA通用液(鏈霉親和素化感光微球)175 μl，再孵育15分鐘;讀取光信號(hào)值(孵育和檢測(cè)均在LiCA HT自動(dòng)完成)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將EPO標(biāo)準(zhǔn)液配制成 0、0.03、0.3、3、15 及 30 ng/ml的系列濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 三種抗體的篩選 1、2、3號(hào)抗體分別進(jìn)行發(fā)光微粒包被及生物素化，將標(biāo)記抗體的發(fā)光微粒1∶100稀釋，將生物素化EPO抗體1∶1 000稀釋，檢測(cè)EPO 0 ng/ml及30 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定2次，采用棋盤格滴定法，通過(guò)LiCA檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，并得出光信號(hào)值及信噪比，根據(jù)較高信號(hào)值及信噪比篩選出雙抗體組合。

1.2.6 最佳反應(yīng)濃度的篩選過(guò)程 選用1∶100、1∶200、1∶300的1號(hào)抗體標(biāo)記的發(fā)光微粒分別與1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000 的 2 號(hào)生物素化抗體進(jìn)行組合，然后對(duì)濃度為0 ng/ml、30 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)2次，采用棋盤格滴定法，通過(guò)LiCA檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，并得出光信號(hào)值及信噪比，根據(jù)較高信號(hào)值及信噪比篩選出最佳反應(yīng)濃度。

1.2.7 檢測(cè)方法的性能驗(yàn)證

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，信號(hào)值為縱坐標(biāo)，通過(guò)ELISA Calc軟件進(jìn)行雙對(duì)數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)換模式的擬合處理，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7.2 靈敏度 以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量15次，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測(cè)定值的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值為檢測(cè)信號(hào)值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的濃度，即為其靈敏度[1]。

1.2.7.3 精密度 取3個(gè)濃度血清質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定，各設(shè)10個(gè)復(fù)孔，計(jì)算各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值，為分析內(nèi)精密度;對(duì)3個(gè)濃度血清質(zhì)控品連續(xù)檢測(cè)15天，各設(shè)1復(fù)孔，計(jì)算各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值，為分析間精密度[2]。1.2.7.4 添加回收試驗(yàn) 回收率取2份質(zhì)控血清(即已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清)，分別加入3份不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(即樣品濃度)，測(cè)回收率。回收率=(實(shí)際濃度/理論濃度)×100%。

1.2.7.5 干擾試驗(yàn) 檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法在干擾性物質(zhì)(溶血、高血脂、高膽紅素)存在的情況下檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)確性。我們對(duì)已知濃度的樣本加入血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.7.6 Hook效應(yīng) 將參考標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀釋成不同濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7.7 方法學(xué)比較 同時(shí)用研發(fā)的雙抗體夾心光激化學(xué)發(fā)光方法及放射免疫分析方法檢測(cè)正常及高值EPO標(biāo)本各51份，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.7.8 正常參考值范圍 用我們建立的光激化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)100份健康人血清，統(tǒng)計(jì)血清EPO水平的分布情況。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件和ELISA Calc對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)性分布的計(jì)量資料采用±s表示，采用pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 確定最佳雙抗體組合 1、2、3號(hào)抗體分別進(jìn)行發(fā)光微粒包被及生物素化，按經(jīng)驗(yàn)將標(biāo)記抗體的發(fā)光微粒1∶100稀釋，將生物素化EPO抗體1∶1 000稀釋，檢測(cè)EPO 0 ng/ml及30 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定2次，采用棋盤格滴定法，通過(guò)LiCA檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)信號(hào)值、信噪比(S/N)值，得出1號(hào)抗體標(biāo)記發(fā)光微粒和2號(hào)抗體標(biāo)記生物素為最佳組合，其信號(hào)值及信噪比最高。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗體標(biāo)記發(fā)光微粒與生物素化抗體配對(duì)結(jié)果(平均值)Tab．1 The result of combination between antibody-labeled light emitting particles and biotinylated antibody(Mean)

2.2 確定最佳反應(yīng)濃度 根據(jù)經(jīng)驗(yàn)我們選用1∶100、1∶200、1∶300 的 1 號(hào)抗體標(biāo)記的發(fā)光微粒分別與 1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000 的 2 號(hào)生物素化抗體進(jìn)行組合，然后對(duì)濃度為0 ng/ml、30 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)2次，采用棋盤格滴定法，通過(guò)LiCA檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其信號(hào)值和信噪比(S/N)值。得出1號(hào)抗體標(biāo)記的發(fā)光微粒濃度為1∶100和2號(hào)抗體標(biāo)記的生物素濃度為1∶1 000為最適反應(yīng)濃度，結(jié)果(平均值)見(jiàn)表2。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用小牛血清作為稀釋液倍比稀釋 EPO 標(biāo)準(zhǔn)品(30 ng/ml)，濃度為 1、5、10、15以及30 ng/ml，濃度的常用對(duì)數(shù)(lgN)作為橫坐標(biāo)，光信號(hào)的常用對(duì)數(shù)(lgG)作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1，線性方程為 y=1.144 x+3.156;r2=0.998 16。

2.4 靈敏度 以“0”標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量15次，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測(cè)定值的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值為檢測(cè)信號(hào)值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出(雙抗夾心法)光激化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)EPO的靈敏度為0.09 ng/ml。

2.5 精密度 用含3、10、30 ng/ml EPO抗原的溶液各測(cè)定10個(gè)復(fù)孔，其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)分別為2.71%、2.10%和3.79%。對(duì)三個(gè)水平EPO抗原的溶液，連續(xù)測(cè)定15天，其批間CV分別是3.26%、3.11%和4.05%，批內(nèi)平均變異系數(shù)為2.93%，批間平均變異系數(shù)為3.86%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 1號(hào)抗體標(biāo)記發(fā)光微粒及2號(hào)抗體標(biāo)記生物素濃度配比信號(hào)值Tab．2 The concentration ratio signal value of No．1 antibody-labeled light emitting particles and No．2 biotinylated antibody

2.6 添加回收試驗(yàn) 將EPO抗原濃度為30 ng/ml和15 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，分別與 EPO濃度為10 ng/ml、3 ng/ml的標(biāo)本按體積比為 1∶9 混合，通過(guò)LiCA法測(cè)得混合后樣本的濃度，計(jì)算測(cè)定值與理論值的比值，從而得出其回收率，見(jiàn)表4、5。

2.7 干擾試驗(yàn) 準(zhǔn)備無(wú)溶血、脂血及黃疸的新鮮混合血漿樣本，EPO濃度為13.29 ng/ml。按體積1∶1比例分別加入高濃度的血紅蛋白(Hb)、甘油三酯(日常工作時(shí)預(yù)留)、總膽紅素(日常工作時(shí)預(yù)留)的干擾血漿，從而獲得干擾樣品，用同樣的方法加入等量的去離子水作為對(duì)照樣品，每個(gè)樣品按照隨機(jī)次序測(cè)定10次，取干擾樣品和對(duì)照樣品各自測(cè)定值的均數(shù)計(jì)算百分比(干擾樣品測(cè)定值/對(duì)照樣品測(cè)定值×100%)，以＜90%和＞110%作為判斷干擾具有臨床意義的標(biāo)準(zhǔn)，在干擾物溶血標(biāo)本血漿血紅蛋白＜20 g/L;脂血標(biāo)本甘油三酯＜10 mmol/L;黃疸標(biāo)本總膽紅素＜200 μmol/L時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均不受干擾。結(jié)果見(jiàn)表6。

圖1 雙抗體夾心光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)EPO標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 The standard curve of double-antibody sandwich LiCA detect EPO

表3 雙抗體夾心光激化學(xué)發(fā)光精密度Tab．3 The precision of double-antibody sandwich LiCA

2.8 Hook效應(yīng) 用BASE稀釋EPO標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為 1、3、5、7.5、10、15、25、30(ng/ml)共 8 個(gè)濃度值，每個(gè)濃度樣品重復(fù)測(cè)定4次，計(jì)算各濃度值測(cè)定值的均數(shù)，本檢測(cè)方法在EPO濃度為0～30 ng/ml內(nèi)未見(jiàn)Hook效應(yīng)(見(jiàn)圖2)。

2.9 方法學(xué)比較 同時(shí)用研發(fā)的雙抗體夾心光激化學(xué)發(fā)光方法及放射免疫分析方法檢測(cè)正常及高值EPO標(biāo)本各 51份，兩種檢測(cè)結(jié)果相比較，用SPSS19.0進(jìn)行線性相關(guān)分析，結(jié)果(圖3)顯示兩種方法在0.01(雙側(cè))水平顯著相關(guān)，r=0.957。

2.10 正常參考值范圍 用我們建立的雙抗體夾心光激化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)100份正常人血標(biāo)本，來(lái)源于身體健康，無(wú)貧血指標(biāo)的體檢人群，其中男性47人，女性53人，每份樣品進(jìn)行雙孔測(cè)定，數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行處理。統(tǒng)計(jì)血清EPO水平的分布情況，計(jì)算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，這100人份的EPO濃度值經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)為正態(tài)分布，均值為3.78 ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)差為1.54。醫(yī)學(xué)參考值范圍的制定通常采用百分位數(shù)法，以2.5～97.5百分位值作為參考值范圍。雙抗體夾心光激化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)EPO參考值范圍:為0.76～6.80 ng/ml。

表4 回收系列樣品的配制Tab．4 The preparation of recovery test sample

表5 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．5 The result of recovery test

表6 血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．6 The interference test result of hemoglobin，triglycerides and bilirubin

圖2 雙抗體夾心模式LiCA Hook實(shí)驗(yàn)檢測(cè)信號(hào)值Fig．2 The Hook experiment signal value of double-antibody sandwich LiCA

圖3 兩種方法檢測(cè)EPO相關(guān)性分析Fig．3 Correlation of two detect EPO methods

3 討論

促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是最早發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子之一。在成人體內(nèi)，EPO絕大部分由腎臟產(chǎn)生，少量來(lái)自肝臟(胎兒及新生兒則主要依靠肝臟產(chǎn)生)。機(jī)體缺氧是腎臟分泌EPO的基本動(dòng)力，腎臟通過(guò)相應(yīng)細(xì)胞(腎皮質(zhì)細(xì)胞等)感受機(jī)體血氧濃度的變化，對(duì)EPO的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)控，從而參與紅細(xì)胞的生成過(guò)程。一旦機(jī)體表現(xiàn)缺氧(由貧血、血容量減少等引起)，腎臟即分泌大量的EPO進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到達(dá)骨髓，作用于造血干細(xì)胞，促使紅細(xì)胞增生，直到紅細(xì)胞的攜氧量達(dá)到機(jī)體正常水平。作為促使造血干細(xì)胞分化的重要成分，對(duì)于紅細(xì)胞生成有著決定性的作用[3]。臨床上EPO的檢測(cè)主要是通過(guò)測(cè)定血清或尿樣中EPO的含量，分析機(jī)體內(nèi)EPO水平，借此判斷貧血程度及貧血原因。

本研究采用的LiCA技術(shù)[4]是一種通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)微球間的結(jié)合，進(jìn)而檢測(cè)分析物含量的方法。在680 nm的激發(fā)光照射下，感光微球中的光敏物質(zhì)受到激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧擴(kuò)散至發(fā)光微粒，與其中的發(fā)光物質(zhì)反應(yīng)，即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時(shí)間很短(約4 μs)，只有那些通過(guò)待測(cè)物連接在一起的發(fā)光微粒和感光微球才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。納米級(jí)的微球增加了反應(yīng)表面積，極大地提高了檢測(cè)靈敏度;恰當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)及時(shí)間分辨計(jì)數(shù)模式，有效提高了信噪比，增加了反應(yīng)的特異性。本研究通過(guò)生物素化EPO抗體與待測(cè)樣本中的EPO及抗EPO抗體包被的發(fā)光微粒以雙抗體夾心模式結(jié)合，再與鏈霉親和素結(jié)合的感光微球共同組成反應(yīng)體系，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生單線氧的能量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，待測(cè)樣本的EPO濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。該方法檢測(cè)EPO的靈敏度較低為0.09 ng/ml;批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)分別為2.93%和3.86%;此外我們檢測(cè)51例EPO增高及51例健康體檢者EPO的結(jié)果與目前常用的放射免疫法檢測(cè)EPO結(jié)果比較具有良好的相關(guān)性(r=0.957)，本檢測(cè)方法的參考范圍為0.76～6.80 ng/ml。此外，本方法操作步驟簡(jiǎn)單方便，具有較好的抗干擾性、較寬的線性范圍(0.09～30 ng/ml)，EPO濃度高達(dá)30 ng/ml時(shí)無(wú)Hook效應(yīng)，是一種實(shí)用可靠的檢測(cè)方法。目前，本研究完成了雙抗體夾心模式光激化學(xué)發(fā)光EPO檢測(cè)方法的建立及方法學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)于臨床上的應(yīng)用價(jià)值還有待對(duì)大量臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析及驗(yàn)證。

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