才讓卓瑪,宋秀紅

(青海省海西州德令哈市畜牧獸醫(yī)工作站 , 青海 德令哈 817000)

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；F(xiàn)代化、集約化發(fā)展，豬群的疫病感染情況日趨復(fù)雜，呈現(xiàn)出多病原的混合感染或繼發(fā)感染[1]?；旌细腥景ú《九c病毒的混合感染、細(xì)菌與細(xì)菌的混合感染以及病毒與細(xì)菌的混合感染[1-2]?；旌细腥境３?dǎo)致豬群的發(fā)病率和死亡率增高，控制難度增加，危害日趨嚴(yán)重[2-3]。在豬場發(fā)生的病毒性疫病中，以豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type，PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、豬瘟病毒Classical Swine Fever virus，CSFV)等4種病毒的感染較為多見，是引起豬繁殖障礙性疫病的主要病原，且PRV、PCV-2、PRRSV、PPV、CSFV等病毒感染后，會損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引起免疫缺陷，降低機(jī)體對外界環(huán)境的抵抗力，常常引起繼發(fā)感染[4-6]。副豬嗜血桿(Haemophilus parasuis，HPs)可以引起豬的格氏病(Glasser's disease)，嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的健康，在全球范圍影響著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[7-8]。HPs多由病毒感染而繼發(fā)，現(xiàn)已報道的有PRRSV和PCV-2繼發(fā)HPs感染[9]，PRV與豬乙型腦炎病毒(JEV)繼發(fā)HPs感染[10]，PRRSV繼發(fā)HPs和大腸桿菌混合感染[11]等。本研究對青海省某規(guī)?；l(fā)病豬場進(jìn)行臨床診斷后，初步認(rèn)為該豬場由PRRSV與PCV-2 2種病毒性疾病繼發(fā)HPs的混合感染所致，為進(jìn)一步確診，本研究結(jié)合豬場疫苗的免疫背景，對采集的臨床具有典型病變特征的組織病料進(jìn)行了常見病毒與細(xì)菌共計13種病原體核酸的分子生物學(xué)檢測與序列鑒定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床診斷與病料的采集

2012年10月青海省某規(guī)?；i場保育豬暴發(fā)了一起以消瘦、體溫升高、兩耳及后軀等部位發(fā)紺、站立不穩(wěn)、后軀無力、個別出現(xiàn)嘔吐及腹瀉物水樣、全身臟器出血或淤血、腫大等為主要臨床特征的傳染病，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢初步診斷為豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒與副豬嗜血桿菌混合感染。無菌采集病死豬的肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等病變組織，作為臨床組織病料樣品，低溫保存和運輸。

1.2 載體與菌株

pMD18-T克隆載體、大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試劑及試劑盒

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、Taq酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、病毒基因組RNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 引物的設(shè)計與合成

分別根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]、參考文獻(xiàn)[2]、參考文獻(xiàn)[12]設(shè)計針對豬鏈球菌(SS)cps2J基因、豬巴氏桿菌(PM)16SrRNA基因、副豬嗜血桿菌(HPS)16SrRNA基因、胸膜肺炎放線桿菌(APP)omlA基因、豬支原體(Mhp) P46基因、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF2基因、豬偽狂犬病毒(PRV)gE基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) ORF7基因、豬細(xì)小病毒(PPV)NS1基因、豬瘟病毒(CSFV)E2基因、豬乙型腦炎病毒(JEV)E基因、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)M基因、豬輪狀病毒(RV )VP7基因、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)N基因的特異性檢測引物，引物序列如表1所示，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

1.5 病料樣品的處理與基因組的提取

將現(xiàn)場采集的臨床組織病料與4倍體積的滅菌生理鹽水充分混合、搗碎、碾磨，反復(fù)凍融3次，離心，將上清液分成3份，分別按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、病毒DNA提取試劑盒的操作步驟分別提取臨床組織病料的細(xì)菌基因組DNA、病毒基因組RNA、病毒基因組DNA。

1.6 RNA病毒的cDNA合成

以提取的組織病料的基因組RNA為模板，分別進(jìn)行PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄總體系為20 μL，含5×M-MLV Buffer 4 μL、dNTP 2 μL、下游引物P2(PRRSV或CSFV或JEV或PEDV或TGEV)0.5 μL、RNA 5 μL、M-MLV 0.5 μL、dd H2O 8 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃水浴1h，70 ℃ 水浴10 min，冰浴。

1.7 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行SS、PM、HPS、APP、Mhp的PCR擴(kuò)增；以提取的病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行PCV-2、PRV、PPV的PCR擴(kuò)增；分別以反轉(zhuǎn)錄合成的PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV 的cDNA為模板，進(jìn)行PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系均為25 μL，含10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上游引物P1(分別為SS、PM、Mhp、APP、HPS、PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV)0.5 μL、下游引物P2(分別為SS、PM、HPS、APP、Mhp、PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV)0.5 μL、Taq 酶0.5 μL、DNA(或cDNA)5 μL、dd H2O 14 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火 45 s(SS 54 ℃、PM 56.5 ℃、HPS 60 ℃、APP 60 ℃、Mhp 52 ℃、PCV-2 57 ℃、PRV 60 ℃、PPV 53 ℃、PRRSV 57 ℃、CSFV 56 ℃、JEV 58 ℃、PEDV 55 ℃、TGEV 55 ℃)，72 ℃ 延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.8 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的序列鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段大小的初步檢測，將與預(yù)期大小相符的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，將其連接至pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定得到陽性克隆質(zhì)粒，將其送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果應(yīng)用blast在線軟件與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比較與分析。

1.9 重復(fù)性檢測試驗

采集豬場不同病死豬的具有典型癥狀的組織病料3份，分別按以上方法進(jìn)行檢測，判定檢測結(jié)果是否一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以提取的細(xì)菌基因組DNA、病毒基因組DNA、以及合成的PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV 的cDNA為模板，分別選用SS、PM、HPS、APP、Mhp、PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV的特異性檢測進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖1所示，HPS、PCV-2、PRV、PRRSV引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別在822 bp、353 bp、178 bp、433 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶，均與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符。

圖1 病料PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000; 1.SS; 2.PM;3.HPS;4.APP;5.Mhp;6.PCV-2;7.PRV;8.PPV;9.PRRSV;10.CSFV;11.JEV;12.PEDV;13.TGEV M.DNA Marker DL 2000; 1.SS; 2.PM;3.HPS;4.APP;5.Mhp;6.PCV-2;7.PRV;8.PPV;9.PRRSV;10.CSFV;11.JEV;12.PEDV;13.TGEV

2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的序列鑒定結(jié)果

分別將HPS、PCV-2、PRV、PRRSV引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化后，連接至pMD18-T載體，經(jīng)PCR鑒定分別得到了陽性克隆質(zhì)粒pMD18-HPS、pMD18-PCV-2、pMD18-PRV、pMD18-PRRSV(如圖2所示)。測序公司對陽性克隆質(zhì)粒pMD18-HPS、pMD18-PCV-2、pMD18-PRV、pMD18-PRRSV的測序結(jié)果顯示，所插入T載體中的特異性序列分別為HPS 16SrRNA基因、PCV-2 ORF2基因、PRV gE基因、PRRSV ORF7基因特異性核苷酸序列。

2.3 重復(fù)性檢測試驗結(jié)果

采集不同病死豬的3份具有典型癥狀的組織病料，其檢測結(jié)果完全一致，說明該豬場確實存在PRV、PCV-2、PRRSV與HPs的混合感染，同時也表明本檢驗方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

圖2 克隆載體的PCR鑒定Fig.2 Identification of cloning vector M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.HPS;2.PCV-2;3.PRV;4.PRRSV M.DNA Marker DL 2000;1.HPS;2.PCV-2;3.PRV;4.PRRSV

3 討 論

近年來，豬病毒性疾病在我國不斷爆發(fā)，已成為影響我國現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)健康快速發(fā)展的主要動物疫病，且多呈混合感染形式存在，并常常繼發(fā)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌等細(xì)菌感染，給臨床病原學(xué)的確診增加了難度，帶來了困難。而分子生物學(xué)診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，給疫病的快速確診開辟了新的視野。PCR方法作為最簡單、最適用的分子生物學(xué)診斷方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快、重復(fù)性好等優(yōu)點，且能夠檢測病原體中特異的核苷酸序列，具有常規(guī)診斷方法無法比擬的準(zhǔn)確性。本病例就是在臨床診斷初步懷疑為PCV-2、PRRSV與HPs混合感染的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了其余10種病原體的PCR檢測，結(jié)果表明該病例中還存在PRV感染，彌補(bǔ)了臨床診斷的局限性。為避免單一病例的特殊性，造成漏檢，本研究選取了不同病死豬的3份病料進(jìn)行了重復(fù)性檢測，檢測結(jié)果完全一致。同時為避免PCR診斷方法存在假陽性的結(jié)果，本研究對PCR擴(kuò)增為陽性的4種病原體的擴(kuò)增產(chǎn)物全部進(jìn)行了克隆和序列測定，鑒定結(jié)果表明所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為4種病原體的特異性核苷酸序列，表現(xiàn)出了極高的準(zhǔn)確性。對于該豬場的致病原因，確定為由PRV、PCV-2、PRRSV混合感染，導(dǎo)致機(jī)體免疫缺陷，引發(fā)HPs的繼發(fā)感染。對于該種混合感染性疫病，目前尚無十分有效的治療方法，豬場應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，遵循“防重于治”的原則，制定合理的免疫程序，確實做好豬群的疫苗免疫接種工作。

參考文獻(xiàn):

[1] 靳明武, 張洋龍, 孫曉雨, 等. 豬藍(lán)耳病和傳染性胸膜肺炎混合感染的病例報告[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2012,24(5):32-35.

[2] 劉志杰, 曾智勇, 湯德元, 等. 豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2012,43(9):1 429-1 436.

[3] Rose N, Eveno E, Grasland B, et al. Individual risk factors for Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in pigs: a hierarchical Bayesian survival analysis[J].Prev Vet Med, 2009, 90(3-4):168-179.

[4] Genzow M, Schwartz K, Gonzalez G, et al. The effect of vaccination against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) on the Porcine circovirus-2 (PCV-2) load in porcine circovirus associated disease (PCVAD) affected pigs[J].Can J Vet Res, 2009, 73(2):87-90.

[5] Fraile L, Calsamiglia M, Mateu E, et al. Prevalence of infection with porcine circovirus-2 (PCV-2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in an integrated swine production system experiencing postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Can J Vet Res, 2009,73(4):308-312.

[6] Opriessnig T, ONeill K, Gerber P F, et al. A PCV2 vaccine based on genotype 2b is more effective than a 2a-based vaccine to protect against PCV2b or combined PCV2a/2b viremia in pigs with concurrent PCV2, PRRSV and PPV infection[J].Vaccine, 2013, 31(3):487-494.

[7] 侯 娜, 張培君, 龔玉梅, 等. 副豬嗜血桿菌潛在毒力因子的綜述[J].中國畜牧獸醫(yī),2013, 40(1):36-41.

[8] Cuesta Gerveno J M, Risco Perez D, Goncalves Blanco P, et al. Fatal infection due to Haemophilus parasuis in a young wild boar (Sus scrofa)[J].J Vet Diagn Invest, 2013,25(2):297-300.

[9] 郭曉秋, 曲哲會. 高致病性豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染的診治[J]. 畜牧與飼料科學(xué),2011,32(6):119.

[10] 劉志杰, 周 莉, 曾智勇, 等. 副豬嗜血桿菌與豬偽狂犬病毒、豬乙型腦炎病毒混合感染的診斷[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(2):99-100.

[11] 苗立中, 劉吉山, 李 峰, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征繼發(fā)副豬嗜血桿菌、大腸桿菌病的診治[J].中國動物檢疫,2010,6(27):60-61.

[12] 劉云波, 趙洪翠, 王志成, 等. 豬病毒性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī),2013, 40(2):204-207.