魏鐵花,李寶龍,劉 旭,賈博宇,周忠光＊,尹麗穎

(1.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)科,廣州深圳518000;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150000)

阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是老年癡呆最常見的一種類型[1-2]。AD是一種多因素相關(guān)的復(fù)雜性疾病,針對單靶點或單致病途徑的藥物療效欠佳。對于針對多靶點、多途徑治療,中藥提取物有其獨特的優(yōu)勢,有望在AD的藥物干預(yù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)新的突破。通天草(waternut Herb,herba eleocharitis)是莎草科植物荸薺(eleocharis dulci)的干燥地上莖,性輕清上逸,可引諸藥入腦,具有補腦、改善腦部血液循環(huán)、剔除腦絡(luò)瘀血的作用,常被用作治療心腦血管疾病的引經(jīng)藥[3]。通天草醇提物和水提物對老年癡呆大鼠腦氧化性損傷具有保護作用,是近年中藥用于治療AD的重點研究藥物之一[4]。本研究旨在探討通天草提取物對擬AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,以及腦組織的病理學(xué)變化,試圖闡明通天草提取物抗AD的作用及其機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 兔抗 NF-κ Bp65、Iκ B-α、GFAP 、S100β多克隆抗體(北京博奧森生物工程有限公司);標(biāo)準(zhǔn)品Aβ1-40(購自Sigma公司),無菌生理鹽水配制成5 g/L,密封37℃恒溫箱培養(yǎng)1周,之后-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。其它試劑均為分析純?/p>

1.2 儀器 Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);微量移液器(美國THERMO公司);生物顯微鏡(德國Leica公司);ChampGel-3200數(shù)字成像儀(北京賽智科技有限公司);SN-2大鼠腦立體定位儀(日本)。

1.3 動物及分組 Wistar大鼠96只,雄性,體質(zhì)量220～250 g,購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。隨機均分為8組:①陰性對照組、②假手術(shù)組、③AD模型組、④西藥治療組、⑤醇低組、⑥醇高組、⑦水低組、⑧水高組。在屏障動物實驗設(shè)施內(nèi)正常飼養(yǎng),給予充足飲水,自由攝食,自然光照。

2 方法

2.1 Aβ1-40海馬微量注射模型組 Aβ1-40海馬內(nèi)注射制造老年性癡呆動物模型是一種公認(rèn)的方法[5]。選擇大鼠右側(cè)海馬為注射靶區(qū),經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后,在前囟后3.5 mm,中線向左旁開2 mm處確定注射點。用微量注射器向腦組織內(nèi)緩慢注射Aβ1-40溶液 2 μ L(10 μ g),牙科泥封住顱骨孔,術(shù)區(qū)用消炎粉消炎,縫合皮膚并消毒。假手術(shù)組選擇大鼠右側(cè)海馬注入等量生理鹽水,其它過程同上。陰性對照組不作任何處理。單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。

2.2 通天草提取物灌胃 將造模成功大鼠隨機分為AD模型對照組、西藥治療組、通天草水提物高劑量組、通天草水提物低劑量組、通天草醇提物高劑量組和通天草醇提物低劑量組,另設(shè)陰性對照組、假手術(shù)組,每組各12只。陰性對照組、假手術(shù)組和AD模型對照組:灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠在造模后第7 d開始灌胃給藥,每日1次,連續(xù)21 d。

2.3 行為學(xué)觀察 現(xiàn)在檢測大鼠記憶力的Morris水迷宮的指標(biāo)有很多,其中最常用的評價指標(biāo)是定位航行實驗的“逃避潛伏期”[6]。在水池內(nèi)裝入純凈自來水,加適量黑色素隱蔽站臺。實驗時將水池均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限區(qū),在第Ⅲ象限中放置1個沒于水下1 cm的站臺(站臺的區(qū)域為E區(qū))。前6 d,每天每只大鼠從4個象限各自固定入水點入水進行訓(xùn)練1次,記錄60 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺所需時間,即逃避潛伏期,共6 d。第7天,撤去站臺,進行空間探索試驗,將大鼠從第Ⅰ象限入水點放人水池,記錄120 s內(nèi)大鼠在池中游泳路徑及在E區(qū)游泳穿越次數(shù),作為評價大鼠學(xué)習(xí)成績的指標(biāo)。

2.4 標(biāo)本制備 水迷宮試驗結(jié)束后2 d,每組大鼠取6只,經(jīng)心臟灌注0.9%生理鹽水250 mL,然后用4%多聚甲醛200 mL緩慢灌注,至動物尸體展開,肢體變硬為止。開顱快速取出完整大腦,固定于上述灌注液中,4℃冰箱保存,用于病理學(xué)和免疫組化檢測。

2.5 免疫組織化學(xué)檢測 1)腦組織固定、脫水、透明、包埋及切片,常規(guī)脫蠟到水;2)用3%H2O2室溫孵育10 min,再用PBS沖洗5 min,重復(fù)3次,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;3)熱修復(fù)抗原:將切片浸入枸椽酸鹽緩沖液(TBS,pH6.0)中,放于微波爐高火加熱至沸騰5 min后,保溫10 min,再加熱5 min,最后自然冷卻至室溫,PBS沖洗3次,每次5 min;4)加入一抗(NF-κ Bp65 1∶50;Iκ B-α 1∶50;GFAP 1∶100;S100β 1∶80),4 ℃冰箱里放置過夜,用PBS緩沖液替代特異的一抗雜交液為陰性對照。PBS沖洗3次,每次5 min;5)加入二抗:向載玻片上滴加二抗,37℃恒溫箱孵育30 min。PBS洗滌5 min×3次;6)DAB溶液顯色:向載玻片中滴加DAB顯色劑,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間約5～30 min;7)復(fù)染及封片:蘇木素中復(fù)染1 min,清水沖洗返藍,然后用梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后觀察。

2.6 結(jié)果分析 采用Motic 3000顯微攝影系統(tǒng)于400倍下拍照,每組隨機選取8張切片,每張切片在海馬CA1-CA3區(qū)隨機攝取3個完全不重疊的視野,采用Motic image advanced 3.2病理圖像分析軟件進行組化分析,并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。陽性表達為淡黃色或棕黃色。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計結(jié)果以( x±s)表示。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件包,先進行單因素方差分析,多組之間比較采用SNK-Q檢驗,進行相關(guān)性分析。P<0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 通天草提取物對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響結(jié)果見表1。

表1 通天草提取物對AD大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)的影響(n=10, x±s)

3.2 通天草提取物對AD大鼠海馬區(qū)組織相關(guān)蛋白 表達的影響 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(n=8, x±s)

4 討論

Morris水迷宮試驗是目前判斷動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的重要試驗方法,該方法規(guī)避了跳臺法和避暗法造成動物防御性反射逼迫學(xué)習(xí)的缺點,減少了動物因驚恐心理而對實驗結(jié)果的影響。[7]

本研究根據(jù)β-淀粉樣蛋白級聯(lián)假說[8],建立Aβ1-40所致AD大鼠模型,利用Morris水迷宮實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通天草提取物能明顯改善Aβ1-40所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。利用免疫組織化學(xué)對腦組織切片中的β-淀粉樣蛋白(Aβ),進行原位定性、定位或定量研究,系統(tǒng)地探討了通天草提取物對Aβ1-40所致AD模型大鼠治療作用及可能機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通天草提取物可顯著降低AD模型大鼠Aβ表達,改善Aβ沉積所造成的神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)損害,減輕腦中炎性反應(yīng),同時通天草提取物能調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)元中NF-κ B/Iκ B蛋白表達和抑制海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和S100β蛋白過度表達。

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