磷酸三酯酶的同源模建及分子對(duì)接理論

鄭文琦,趙 麗,宋亞偉,韓葳葳

(1. 吉林建筑工程學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)部,長(zhǎng)春 130118；2. 吉林大學(xué) 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130012)

有機(jī)磷農(nóng)藥是一種廣泛使用的高效殺蟲(chóng)劑,但其嚴(yán)重污染土壤和地下水,導(dǎo)致生物物種減少和滅絕,破壞生態(tài)平衡. 而且大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥為神經(jīng)毒素,對(duì)人等非靶標(biāo)生物會(huì)產(chǎn)生直接或間接的毒性效應(yīng)[1-2]. 目前,微生物降解是清理有機(jī)磷農(nóng)藥殘余最安全高效的方法. 磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶(phosphotriesterase-like lactonases,PLLs)是降解有機(jī)磷毒劑最主要的酶類(lèi),具有降解磷酸三酯和內(nèi)酯的雙重功能[3],文獻(xiàn)[4]報(bào)道了其降解活力,文獻(xiàn)[5-6]將其定義為一個(gè)新的酶類(lèi). 但大多數(shù)PLLs磷酸三酯酶活力較低. 本文以來(lái)源于Thermaerobactermarianensis的磷酸三酯酶為研究對(duì)象[7],利用同源模建和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法建立蛋白三維結(jié)構(gòu),通過(guò)與磷酸三酯底物和內(nèi)酯底物對(duì)接的研究,確定了形成復(fù)合物起重要作用的氨基酸殘基.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 理論方法 同源模建采用3D-JIGSAW服務(wù)器. 來(lái)源于Thermaerobacterm的磷酸三酯酶包含331個(gè)殘基(NCBI Reference Sequence: YP_004102636.1 EC 3.1.1.8),通過(guò)3D-JIGSAW建模建立其三維結(jié)構(gòu). 先利用Amber全原子力場(chǎng)和GROMACS4.3.1軟件對(duì)其進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化[8],再經(jīng)過(guò)7 ns 分子動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化其結(jié)構(gòu).

1.2 分子對(duì)接 先在已知晶體結(jié)構(gòu)的磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶中找到包含配體結(jié)構(gòu)N-丁?；?DL-高絲氨酸內(nèi)酯(PDB code 3ojg),再根據(jù)配體在活性中心的位置設(shè)定中心坐標(biāo),將TsPLLs和3ojg的坐標(biāo)重疊,使用已設(shè)定的中心坐標(biāo)和BOX,利用Autodock軟件對(duì)不同的底物進(jìn)行對(duì)接,并根據(jù)配體的不同構(gòu)象、 方向及位置進(jìn)行評(píng)分和排序后,使用CDOKER軟件對(duì)最適底物進(jìn)行柔性對(duì)接,以研究酶與底物結(jié)合時(shí)的重要?dú)埢? 金屬離子采用Zn2+.

2 結(jié)果與討論

通過(guò)NCBI的BLAST搜索可知,TmPLLs同源性最高(61%)來(lái)源于Geobacillus Stearothermophilus Strain 10的有機(jī)磷水解酶(PDB code 3F4D[9]),其序列對(duì)比如圖1所示.

圖1 TmPLLs的序列對(duì)比Fig.1 Sequence alignment of TmPLLs

圖2 TmPLLs的RMSDFig.2 RMSD of TmPLLs

TmPLLs結(jié)構(gòu)由3D-JIGSAW軟件在線構(gòu)建,構(gòu)建的結(jié)構(gòu)包含331個(gè)殘基. 圖2為T(mén)mPLLs通過(guò)Gromacs 軟件包進(jìn)行7 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬的均方根偏差(RMSD). 由圖2可見(jiàn),經(jīng)過(guò)5 ns的動(dòng)力學(xué)模擬,酶的體系已經(jīng)穩(wěn)定,RMSD約為0.17.

利用Profile-3D評(píng)估優(yōu)化后的結(jié)構(gòu),其分值為136.09,接近最高得分150.74,遠(yuǎn)高于最低得分67.83. 使用MolProbity[10]評(píng)估二面角,其91.5%殘基的二面角在允許范圍內(nèi). 因此,TmPLLs的結(jié)構(gòu)可靠.

磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶具有磷酸三酯酶和內(nèi)酯酶的雙重功能[9]. 為驗(yàn)證TmPLLs的底物選擇性,本文進(jìn)行分子對(duì)接研究， 先根據(jù)已知帶有配體的結(jié)構(gòu)(PDB code 30jg)設(shè)置BOX . 表1為磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶和N-丁?；?DL-高絲氨酸內(nèi)酯的對(duì)接能量得分. 由表1可見(jiàn),BOX設(shè)置為44最合適.

表1 磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶和N-丁?；?DL-高絲氨酸內(nèi)酯的對(duì)接能量得分Table 1 Docking score between TmPLLs and N-butyryl-DL-homoserine lactone

將TsPLLs和3ojg的坐標(biāo)重疊,在已經(jīng)設(shè)定的中心坐標(biāo)和BOX(44)上分別使用3種磷酸三酯底物(乙基對(duì)氧磷,甲基對(duì)氧磷和內(nèi)吸磷-S)和3種內(nèi)酯底物(γ-壬內(nèi)酯,δ-十一內(nèi)酯和N-高絲氨酸內(nèi)酯),通過(guò)Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接研究,結(jié)果列于表2. 由表2可見(jiàn)：3種磷酸三酯底物中,乙基對(duì)氧磷和酶的結(jié)合自由能最低;3種內(nèi)酯底物中,γ-壬內(nèi)酯和酶的結(jié)合自由能最低.

表2 結(jié)合自由能的計(jì)算結(jié)果Table 2 Free binding energies calculated

為進(jìn)一步確定磷酸三酯底物和內(nèi)酯底物活性位點(diǎn)的重要氨基酸殘基,使用CDOCKER軟件對(duì)乙基對(duì)氧磷和γ-壬內(nèi)酯柔性對(duì)接,活性位點(diǎn)殘基用文獻(xiàn)[9]報(bào)道的Phe28,Cys74,Tyr99,Tyr100,Val268，Trp271,Arg230,Ile233,Phe236，Val237,Trp289.

圖3為γ-壬內(nèi)酯與酶結(jié)合時(shí)的重要氨基酸殘基,包括Phe28,His25,Arg44,Arg76,His34,Ile233,Arg230,Phe236,Ser235,Asp266,Trp289,Ser267,Asn269,Val268. 其中Arg44和His25與底物形成的氫鍵如圖4所示. Phe28,Arg230和Phe236是活性點(diǎn)的重要氨基酸殘基,與文獻(xiàn)[10]結(jié)果一致.

圖3 γ-壬內(nèi)酯與酶結(jié)合的氨基酸殘基Fig.3 Active residues of TmPLLs-γ-nonanoic lactone complex

圖4 γ-壬內(nèi)酯與His25,Arg44形成的氫鍵Fig.4 Hydrogen bonds between γ-nonanoic lactone and His25,Arg44

圖5為乙基對(duì)氧磷與酶結(jié)合時(shí)的重要氨基酸殘基,包括His25,Phe28,His34,Arg44,Gly102,His178,Arg230,Ile233,Phe236,Val268,Asp266,Asn269,Trp289. 其中Arg44,Arg230和底物形成2個(gè)氫鍵,如圖6所示. 由圖3～圖6可見(jiàn),Arg44是底物(磷酸三酯和內(nèi)酯)與酶結(jié)合時(shí)的重要氨基酸殘基,這是因?yàn)锳rg44與不同的底物均可形成氫鍵,而氫鍵在酶催化活動(dòng)中的作用較大,可使復(fù)合物的體系穩(wěn)定,為定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)提供可靠線索.

圖5 乙基對(duì)氧磷與酶結(jié)合的氨基酸殘基Fig.5 Active residues of ethyl paraoxon-TmPLLs

圖6 乙基對(duì)氧磷與Arg230,Arg44形成的氫鍵Fig.6 Hydrogen bonds between ethyl paraoxon and Arg230,Arg44

底物入口殘基對(duì)酶催化活性的變化具有重要作用. 通過(guò)文獻(xiàn)[9]和序列對(duì)比可知,TsPLLs的入口殘基為T(mén)yr100和Val237. 本文構(gòu)建出PLLs的Y99W突變體,Tyr99鄰近入口,與野生型的PLLs比較,突變體酶分子的表面靜電勢(shì)提高,表明疏水性增強(qiáng),如圖7所示. 突變體比野生型入口殘基的直徑小,如圖8所示. 由圖8可見(jiàn),突變體入口殘基V237與Y100的直徑為20.80 nm,野生型入口殘基的直徑為22.21 nm. 通過(guò)CASTp軟件分析活性口袋大小: 野生型為874.9 nm3,突變體為917.3 nm3,可見(jiàn)突變體口袋變大. 上述變化均對(duì)酶的催化效率產(chǎn)生有益影響,因此Y99W的突變體可提高酶活力.

圖7 野生型PLLs (A)與突變體PLLs (B)的表面靜電勢(shì)Fig.7 Protein contact potentials of WT PLLs (A) and PLLs Y99W mutant (B)

圖8 野生型PLLs (A)和突變體 PLLs (B)的入口直徑Fig.8 Diameters of entrance gates of WT PLLs (A) and PLLs Y99W mutant (B)

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