劉倩,陳基權(quán),戴志剛,溫嵐,龔友才,粟建光
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所,湖南長(zhǎng)沙410205)
紅麻(Hibiscus cannabinus L)為錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維植物,具有纖維產(chǎn)量高、耐旱、耐鹽堿、易栽培等特性。紅麻具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值,纖維可用來(lái)生產(chǎn)麻袋、墻布、窗簾布等,秸稈可用來(lái)造紙、生產(chǎn)輕型板材、活性炭、汽車內(nèi)襯等,被視為21世紀(jì)潛在的優(yōu)勢(shì)作物。紅麻分布很廣,遍及世界各地,中國(guó)、印度、泰國(guó)是世界紅麻的主產(chǎn)國(guó)。迄今,我國(guó)已收集紅麻種質(zhì)資源1800多份,包括由國(guó)外引進(jìn)品種、地方品種、育成品種、野生種、野生近緣種和育種中間材料及創(chuàng)新材料組成。科學(xué)準(zhǔn)確地鑒定紅麻品種及種質(zhì)資源材料的遺傳特性,對(duì)紅麻遺傳資源保護(hù)和利用、遺傳資源評(píng)價(jià)、種子質(zhì)量鑒定和品種權(quán)益保護(hù)具有重要意義[1]。郭安平等用16個(gè)RAPD引物對(duì)25份紅麻及其近緣材料進(jìn)行親緣關(guān)系研究,多態(tài)性條帶比率為77.6%,根據(jù)得到的DNA指紋圖譜計(jì)算其Nei氏相似指數(shù)和遺傳距離,并構(gòu)建了系統(tǒng)樹[2]。程舟等用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅麻種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了紅麻起源于非洲的假設(shè),并證實(shí)了栽培紅麻首先被引到亞洲,并進(jìn)一步被傳播到中北美洲[3]。汪斌等對(duì)51份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行耐寒性初步鑒定研究,鑒定篩選出7個(gè)耐寒性較強(qiáng)的紅麻種質(zhì)材料[4]。林荔輝等用13個(gè)ISSR引物對(duì)32份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系研究,發(fā)現(xiàn)紅麻多數(shù)栽培品種遺傳基礎(chǔ)狹窄[5]。陳美霞等利用SRAP、ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅麻遺傳連鎖圖的構(gòu)建進(jìn)行了初步研究[6]。祁偉等利用28個(gè)ISSR引物繪制出82個(gè)紅麻品種的DNA指紋圖譜,為紅麻種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)[7]。本研究選用來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的48份紅麻種質(zhì)資源,利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳分析,繪制指紋圖譜,為在分子水平上區(qū)分這些種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù),為研究和利用這些種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)。
從國(guó)家麻類種質(zhì)資源中期庫(kù)保存的紅麻種質(zhì)資源中選取48份(表1),其中包括尼泊爾、美國(guó)、加納、澳大利亞等17個(gè)國(guó)家引進(jìn)和國(guó)內(nèi)育成的34份栽培品種,8份野生種和6份近緣種。
1.2.1 DNA提取
對(duì)供試材料的種子進(jìn)行暗箱培養(yǎng),取黃化苗的下胚軸按照改良CTAB法提取基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),純化后保存在-20℃冰箱中。
1.2.2 PCR反應(yīng)
以加納紅、911-4、ZB440、GA42、H192、ZM401的基因組 DNA 為模板,對(duì)225對(duì) SPAP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選,SRAP引物均購(gòu)自于上海生工生物技術(shù)有限公司(表2)。SRAP反應(yīng)體系10mol,含有1mmol/L 10 ×PCR Buffer(含 Mg2+),187.5μmol/L dNTP,1.25U Taq DNA 聚合酶,0.6μmol/L SRAP引物及10ng DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;反應(yīng)前5個(gè)熱循環(huán),每個(gè)熱循環(huán)包括94℃變性1min,33℃退火1min,72℃延伸1min;隨后的34個(gè)熱循環(huán)復(fù)性溫度提高到52℃,循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min,并在4℃下保存。
表2 SRAP引物序列Tab.2 Sequences of the SRAP primers
1.2.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)
用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳介質(zhì)為1×TBE緩沖液,電泳后采用銀染法染色,照相,記錄試驗(yàn)結(jié)果。
對(duì)于48份紅麻種質(zhì)資源的SRAP擴(kuò)增譜帶,按照條帶的分子量從大到小讀取。同一位點(diǎn)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)記“1”,不出現(xiàn)記“0”,將擴(kuò)增譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋。根據(jù)SRAP擴(kuò)增譜帶結(jié)果,用NTSYS 2.1軟件分析48份紅麻種質(zhì)資源之間的遺傳相似系數(shù),用類平均法(UPGMA)對(duì)其進(jìn)行聚類分析并繪制系統(tǒng)樹。
以加納紅、911-4、ZB440、GA42、H192、ZM401的基因組 DNA 為模板,對(duì)225對(duì) SPAP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選,采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離SRAP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,共篩選出30對(duì)多態(tài)性好、條帶清晰的SRAP引物,以這30對(duì)引物對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行SRAP擴(kuò)增,圖1為引物組合ME1/EM9對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果。30對(duì)SRAP引物擴(kuò)增48份紅麻種質(zhì)資源,共獲得284條譜帶,平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9.47條譜帶,其中多態(tài)性譜帶268條,多態(tài)性條帶比率為94.4%,表明供試的48份紅麻種質(zhì)資源遺傳多樣性比較豐富。
圖1 引物組合ME1/EM9對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源的擴(kuò)增圖譜Fig.1 SRAP patterns amplified by the primer combination ME1/EM9
篩選出的SRAP引物組合共擴(kuò)增出8條特征帶,可鑒別出8份材料(表3),包括4個(gè)栽培品種、1個(gè)野生種和3個(gè)近緣種。由于具有特征條帶的材料較少,因此要通過特征條帶和多種引物組合結(jié)合的方法鑒別所有種質(zhì)材料。
表3 SRAP標(biāo)記擴(kuò)增出的特征帶Tab.3 Typical bands amplified with SRAP markers
基于SRAP擴(kuò)增譜帶,用UPGMA法對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析,遺傳相似系數(shù)為0.60-0.93,以遺傳相似系數(shù)0.74劃分,48份紅麻種質(zhì)資源可以劃分為四個(gè)類群(圖2)。Ⅰ類群包括所有34個(gè)栽培品種和近緣種H182,說明H182與紅麻栽培品種親緣關(guān)系較近;Ⅱ類群包括所有供試野生種,ZB361和GA42親緣關(guān)系最近,其次與ZB440親緣關(guān)系較近,ZB361和ZB440均來(lái)自贊比亞,GA42來(lái)自加納,說明親緣關(guān)系與來(lái)源地關(guān)系不大。Ⅲ類群包括三個(gè)H.sabdariffa近緣種,玫瑰茄H196、H189、H192;Ⅳ類群包括兩個(gè)H.acetosella近緣種,紅葉槿H208和H118。
圖2 127份紅麻種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster of 127 kenaf germplasm analyzed by UPGMA
結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性條帶的數(shù)量和所能鑒別材料的數(shù)目?jī)蓚€(gè)方面考慮,選用M2/E10、M10/E9、M10/E3、M10/E1、M10/E2、M9/E3、M9/E7、M9/E5、M6/E3 這 9 對(duì) SRAP 核心引物組合構(gòu)建了48份紅麻種質(zhì)資源的指紋圖譜(圖3),9對(duì)SRAP核心引物組合14條譜帶就可以完全區(qū)分48份紅麻種質(zhì)資源。
本研究利用SRAP標(biāo)記對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析并構(gòu)建指紋圖譜。相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)是一種基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng),是由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬植物中開發(fā)出來(lái)的。由于SRAP標(biāo)記是對(duì)基因組的重要組成部分開放閱讀框(ORF)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,因此能夠比較全面地揭示遺傳種質(zhì)資源的遺傳特征,而且具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。
林荔輝等[5]等利用ISSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自20個(gè)國(guó)家的32份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析,遺傳相似系數(shù)為0.62-0.90。郭安平等[2]用RAPD標(biāo)記對(duì)25份紅麻及其近緣種進(jìn)行了遺傳分析,遺傳相似系數(shù)在0.79-0.98之間,表明其遺傳基礎(chǔ)都比較狹窄。本研究的供試材料遺傳相似系數(shù)為0.60-0.93,表明材料間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),遺傳基礎(chǔ)較寬。48份紅麻種質(zhì)資源來(lái)源于不同國(guó)家和地區(qū),不僅有從國(guó)外引進(jìn)的遺傳背景差異較大的材料,也有來(lái)自同一個(gè)育種單位遺傳背景相近的材料,9對(duì)SRAP核心引物組合14條譜帶就可以完全區(qū)分48份紅麻種質(zhì)資源,指紋圖譜帶型全部相同的概率為6.1×10-5,構(gòu)建的指紋圖譜適用于48份紅麻種質(zhì)資源的分類與鑒定。鑒定大范圍的紅麻種質(zhì)資源群體時(shí),可能會(huì)出現(xiàn)同一引物在不同品種中擴(kuò)增出相同譜帶的現(xiàn)象,對(duì)此,要結(jié)合不同分子標(biāo)記和增加引物數(shù)等方法來(lái)區(qū)分不同品種。構(gòu)建指紋圖譜可以為紅麻種質(zhì)資源的鑒定、利用及紅麻育種工作提供理論基礎(chǔ)。
圖3 SRAP標(biāo)記構(gòu)建的48紅麻種質(zhì)資源指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of 48 kenaf germplasm set up by SRAP markers
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