劉倩，陳基權(quán)，戴志剛，溫嵐，龔友才，粟建光

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長(zhǎng)沙410205)

紅麻(Hibiscus cannabinus L)為錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維植物，具有纖維產(chǎn)量高、耐旱、耐鹽堿、易栽培等特性。紅麻具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，纖維可用來(lái)生產(chǎn)麻袋、墻布、窗簾布等，秸稈可用來(lái)造紙、生產(chǎn)輕型板材、活性炭、汽車內(nèi)襯等，被視為21世紀(jì)潛在的優(yōu)勢(shì)作物。紅麻分布很廣，遍及世界各地，中國(guó)、印度、泰國(guó)是世界紅麻的主產(chǎn)國(guó)。迄今，我國(guó)已收集紅麻種質(zhì)資源1800多份，包括由國(guó)外引進(jìn)品種、地方品種、育成品種、野生種、野生近緣種和育種中間材料及創(chuàng)新材料組成。科學(xué)準(zhǔn)確地鑒定紅麻品種及種質(zhì)資源材料的遺傳特性，對(duì)紅麻遺傳資源保護(hù)和利用、遺傳資源評(píng)價(jià)、種子質(zhì)量鑒定和品種權(quán)益保護(hù)具有重要意義［1］。郭安平等用16個(gè)RAPD引物對(duì)25份紅麻及其近緣材料進(jìn)行親緣關(guān)系研究，多態(tài)性條帶比率為77.6%，根據(jù)得到的DNA指紋圖譜計(jì)算其Nei氏相似指數(shù)和遺傳距離，并構(gòu)建了系統(tǒng)樹［2］。程舟等用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅麻種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了紅麻起源于非洲的假設(shè)，并證實(shí)了栽培紅麻首先被引到亞洲，并進(jìn)一步被傳播到中北美洲［3］。汪斌等對(duì)51份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行耐寒性初步鑒定研究，鑒定篩選出7個(gè)耐寒性較強(qiáng)的紅麻種質(zhì)材料［4］。林荔輝等用13個(gè)ISSR引物對(duì)32份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)紅麻多數(shù)栽培品種遺傳基礎(chǔ)狹窄［5］。陳美霞等利用SRAP、ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅麻遺傳連鎖圖的構(gòu)建進(jìn)行了初步研究［6］。祁偉等利用28個(gè)ISSR引物繪制出82個(gè)紅麻品種的DNA指紋圖譜，為紅麻種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)［7］。本研究選用來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的48份紅麻種質(zhì)資源，利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳分析，繪制指紋圖譜，為在分子水平上區(qū)分這些種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)，為研究和利用這些種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從國(guó)家麻類種質(zhì)資源中期庫(kù)保存的紅麻種質(zhì)資源中選取48份(表1)，其中包括尼泊爾、美國(guó)、加納、澳大利亞等17個(gè)國(guó)家引進(jìn)和國(guó)內(nèi)育成的34份栽培品種，8份野生種和6份近緣種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

對(duì)供試材料的種子進(jìn)行暗箱培養(yǎng)，取黃化苗的下胚軸按照改良CTAB法提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，純化后保存在－20℃冰箱中。

1.2.2 PCR反應(yīng)

以加納紅、911－4、ZB440、GA42、H192、ZM401的基因組 DNA 為模板，對(duì)225對(duì) SPAP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，SRAP引物均購(gòu)自于上海生工生物技術(shù)有限公司(表2)。SRAP反應(yīng)體系10mol，含有1mmol/L 10 ×PCR Buffer(含 Mg2+)，187.5μmol/L dNTP，1.25U Taq DNA 聚合酶，0.6μmol/L SRAP引物及10ng DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;反應(yīng)前5個(gè)熱循環(huán)，每個(gè)熱循環(huán)包括94℃變性1min，33℃退火1min，72℃延伸1min;隨后的34個(gè)熱循環(huán)復(fù)性溫度提高到52℃，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min，并在4℃下保存。

表2 SRAP引物序列Tab.2 Sequences of the SRAP primers

1.2.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳介質(zhì)為1×TBE緩沖液，電泳后采用銀染法染色，照相，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于48份紅麻種質(zhì)資源的SRAP擴(kuò)增譜帶，按照條帶的分子量從大到小讀取。同一位點(diǎn)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)記“1”，不出現(xiàn)記“0”，將擴(kuò)增譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋。根據(jù)SRAP擴(kuò)增譜帶結(jié)果，用NTSYS 2.1軟件分析48份紅麻種質(zhì)資源之間的遺傳相似系數(shù)，用類平均法(UPGMA)對(duì)其進(jìn)行聚類分析并繪制系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物對(duì)供試材料的SRAP分析

以加納紅、911－4、ZB440、GA42、H192、ZM401的基因組 DNA 為模板，對(duì)225對(duì) SPAP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離SRAP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，共篩選出30對(duì)多態(tài)性好、條帶清晰的SRAP引物，以這30對(duì)引物對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，圖1為引物組合ME1/EM9對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果。30對(duì)SRAP引物擴(kuò)增48份紅麻種質(zhì)資源，共獲得284條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9.47條譜帶，其中多態(tài)性譜帶268條，多態(tài)性條帶比率為94.4%，表明供試的48份紅麻種質(zhì)資源遺傳多樣性比較豐富。

圖1 引物組合ME1/EM9對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源的擴(kuò)增圖譜Fig.1 SRAP patterns amplified by the primer combination ME1/EM9

2.2 特征譜帶分析

篩選出的SRAP引物組合共擴(kuò)增出8條特征帶，可鑒別出8份材料(表3)，包括4個(gè)栽培品種、1個(gè)野生種和3個(gè)近緣種。由于具有特征條帶的材料較少，因此要通過特征條帶和多種引物組合結(jié)合的方法鑒別所有種質(zhì)材料。

表3 SRAP標(biāo)記擴(kuò)增出的特征帶Tab.3 Typical bands amplified with SRAP markers

2.3 聚類分析

基于SRAP擴(kuò)增譜帶，用UPGMA法對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，遺傳相似系數(shù)為0.60－0.93，以遺傳相似系數(shù)0.74劃分，48份紅麻種質(zhì)資源可以劃分為四個(gè)類群(圖2)。Ⅰ類群包括所有34個(gè)栽培品種和近緣種H182，說明H182與紅麻栽培品種親緣關(guān)系較近;Ⅱ類群包括所有供試野生種，ZB361和GA42親緣關(guān)系最近，其次與ZB440親緣關(guān)系較近，ZB361和ZB440均來(lái)自贊比亞，GA42來(lái)自加納，說明親緣關(guān)系與來(lái)源地關(guān)系不大。Ⅲ類群包括三個(gè)H.sabdariffa近緣種，玫瑰茄H196、H189、H192;Ⅳ類群包括兩個(gè)H.acetosella近緣種，紅葉槿H208和H118。

圖2 127份紅麻種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster of 127 kenaf germplasm analyzed by UPGMA

2.4 指紋圖譜構(gòu)建

結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性條帶的數(shù)量和所能鑒別材料的數(shù)目?jī)蓚€(gè)方面考慮，選用M2/E10、M10/E9、M10/E3、M10/E1、M10/E2、M9/E3、M9/E7、M9/E5、M6/E3 這 9 對(duì) SRAP 核心引物組合構(gòu)建了48份紅麻種質(zhì)資源的指紋圖譜(圖3)，9對(duì)SRAP核心引物組合14條譜帶就可以完全區(qū)分48份紅麻種質(zhì)資源。

3 討論

本研究利用SRAP標(biāo)記對(duì)48份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析并構(gòu)建指紋圖譜。相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)是一種基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，是由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬植物中開發(fā)出來(lái)的。由于SRAP標(biāo)記是對(duì)基因組的重要組成部分開放閱讀框(ORF)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，因此能夠比較全面地揭示遺傳種質(zhì)資源的遺傳特征，而且具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。

林荔輝等［5］等利用ISSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自20個(gè)國(guó)家的32份紅麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，遺傳相似系數(shù)為0.62－0.90。郭安平等［2］用RAPD標(biāo)記對(duì)25份紅麻及其近緣種進(jìn)行了遺傳分析，遺傳相似系數(shù)在0.79－0.98之間，表明其遺傳基礎(chǔ)都比較狹窄。本研究的供試材料遺傳相似系數(shù)為0.60－0.93，表明材料間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳基礎(chǔ)較寬。48份紅麻種質(zhì)資源來(lái)源于不同國(guó)家和地區(qū)，不僅有從國(guó)外引進(jìn)的遺傳背景差異較大的材料，也有來(lái)自同一個(gè)育種單位遺傳背景相近的材料，9對(duì)SRAP核心引物組合14條譜帶就可以完全區(qū)分48份紅麻種質(zhì)資源，指紋圖譜帶型全部相同的概率為6.1×10－5，構(gòu)建的指紋圖譜適用于48份紅麻種質(zhì)資源的分類與鑒定。鑒定大范圍的紅麻種質(zhì)資源群體時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)同一引物在不同品種中擴(kuò)增出相同譜帶的現(xiàn)象，對(duì)此，要結(jié)合不同分子標(biāo)記和增加引物數(shù)等方法來(lái)區(qū)分不同品種。構(gòu)建指紋圖譜可以為紅麻種質(zhì)資源的鑒定、利用及紅麻育種工作提供理論基礎(chǔ)。

圖3 SRAP標(biāo)記構(gòu)建的48紅麻種質(zhì)資源指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of 48 kenaf germplasm set up by SRAP markers

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