鄭 瑞，周方方，林 萍，姚小華，陸 暢，張小平，①

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖241000;2.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽311400)

油茶(Camellia oleifera Abel)又名茶子樹、茶油樹、百花茶，為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia Linn.)多年生常綠小喬木，是中國特有的食用油料樹種，系世界四大木本油料樹種之一。茶油以單不飽和脂肪酸為主要成分，且富含VA和VE等，營養(yǎng)價值高，素有“液體黃金”的美譽(yù)。近年來中國油茶種植業(yè)發(fā)展迅速，油茶種植面積迅速增加［1］。

油茶是中國南方最重要的木本食用油料樹種，分布廣、面積大，但產(chǎn)量低且不穩(wěn)定。因此，培育高產(chǎn)、性能穩(wěn)定的油茶新品種非常重要［2］。雜交育種是油茶育種的重要手段，但前提是必須對目前眾多的油茶品種進(jìn)行分類。

葉片作為植物的重要器官之一，其解剖學(xué)特征可作為種間或種下類群的分類依據(jù)。為此，作者采用石蠟切片法，從植物解剖學(xué)角度研究并探討不同油茶品種葉片及其中脈橫切面解剖結(jié)構(gòu)的異同，分析其相關(guān)性和差異性，并在此基礎(chǔ)上對供試的61個油茶品種進(jìn)行比較與歸類，以期為油茶品種分類提供形態(tài)解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試61個油茶品種全部于2009年11月取自浙江富陽油茶基地(浙江東方紅林場)，包括紅花油茶系列(Honghuayoucha series)的6個品種‘dy46’、‘fy7’、‘hy114’、‘dy156’、‘hy1’和‘hy17’;長林系列(Changlin series)的 43個品種‘長林 27號’(‘Changlin 27’)、‘長林 21 號’(‘Changlin 21’)、‘長林91號’(‘Changlin 91’)、‘長林185號’(‘Changlin 185’)、‘長林 219 號’(‘Changlin 219’)、‘長林 15號’(‘Changlin 15’)、‘長林81號’(‘Changlin 81’)、‘長林 90 號’(‘Changlin 90’)、‘長林 94 號’(‘Changlin 94’)、‘長林 145 號’(‘Changlin 145’)、‘長林 152號’(‘Changlin 152’)、‘長林 20號’(‘Changlin 20’)、‘長林 29 號’(‘Changlin 29’)、‘長林31號’(‘Changlin 31’)、‘長林 40號’(‘Changlin 40’)、‘長林 46 號’(‘Changlin 46’)、‘長林 52 號’(‘Changlin 52’)、‘長林54 號’(‘Changlin 54’)、‘長林56號’(‘Changlin 56’)、‘長林 65號’(‘Changlin 65’)、‘長林 67 號’(‘Changlin 67’)、‘長林 72 號’(‘Changlin 72’)、‘長林82 號’(‘Changlin 82’)、‘長林87號’(‘Changlin 87’)、‘長林 88號’(‘Changlin 88’)、‘長林 89 號’(‘Changlin 89’)、‘長林 95 號’(‘Changlin 95’)、‘長林96 號’(‘Changlin 96’)、‘長林97號’(‘Changlin 97’)、‘長林 98號’(‘Changlin 98’)、‘長林99號’(‘Changlin 99’)、‘長林 100 號’(‘Changlin 100’)、‘長林101 號’(‘Changlin 101’)、‘長林 102 號’(‘Changlin 102’)、‘長林 106 號’(‘Changlin 106’)、‘長林119 號’(‘Changlin 119’)、‘長林 151 號’(‘Changlin 151’)、‘長林 153 號’(‘Changlin 153’)、‘長林155 號’(‘Changlin 155’)、‘長林 161 號’(‘Changlin 161’)、‘長林 162 號’(‘Changlin 162’)、‘長林 182 號’(‘Changlin 182’)和‘長林 214號’(‘Changlin 214’);湘林系列(Xianglin series)品種‘湘 5’(‘Xiang 5’);閩優(yōu)系列(Minyou series)的5個品種‘閩優(yōu)2’(‘Minyou 2’)、‘閩優(yōu)6’(‘Minyou 6’)、‘閩優(yōu) 10’(‘Minyou 10’)、‘閩優(yōu) 11’(‘Minyou 11’)和‘閩優(yōu) 43’(‘Minyou 43’);桐系列(Tong series)品種‘桐11’(‘Tong 11’);贛系列(Gan series)品種‘贛1’(‘Gan 1’);桂無系列(Guiwu series)品種‘桂3’(‘Gui 3’)和‘桂4’(‘Gui 4’);亞家系列(Yajia series)品種‘亞家 1’(‘Yajia 1’)以及作為對照的品種‘無’(‘Wu’)［2］。

從各品種的多棵樣株上隨機(jī)選取10片生長正常且大小一致的葉片［3］，用 FAA(含體積分?jǐn)?shù)70%乙醇)固定。

1.2 石蠟切片制作方法

取固定后的油茶葉片，依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、85%、95%和100%乙醇(重復(fù)1次)、V(100%乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1(重復(fù)1次)、二甲苯(重復(fù)2次)梯度脫水和透明;然后逐級透蠟，透蠟時間為2 d。用石蠟切片機(jī)切片，切片厚度10 μm，番紅－固綠對染，用中性樹膠封片制成永久切片。

1.3 觀察和測量方法

用Motic顯微鏡對切片進(jìn)行觀察并拍照。利用Motic軟件進(jìn)行測量，并用MATLAB軟件對葉片解剖特征進(jìn)行聚類分析［4］。

葉片橫切面(除中脈)解剖結(jié)構(gòu)特征包括葉片厚度、柵欄組織厚度和細(xì)胞層數(shù)、海綿組織厚度和細(xì)胞形狀、柵欄組織與海綿組織的厚度比、上表皮厚度和下表皮厚度。每個品種隨機(jī)選取10片葉片，每一葉片選3個橫切面切片，每張切片觀察3個視野，每個視野分別測量1個數(shù)據(jù)，即每個品種每項解剖特征測量90組數(shù)據(jù)，計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。并按以下公式［5］計算葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度(leaf tissue structure loose ratio，RL)和葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(leaf tissue structure tense ratio，RT):RL=(海綿組織厚度/葉片厚度)×100%;RT=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%。

葉片中脈解剖結(jié)構(gòu)特征包括葉片中脈厚度、木質(zhì)部厚度、韌皮部厚度、維管束短徑、韌皮部厚度與維管束短徑比、木質(zhì)部厚度與維管束短徑比、維管束短徑與葉脈厚度比。每個品種隨機(jī)選取10片葉片，每一葉片選取3個中脈橫切面切片，每張切片觀察3個視野，每個視野分別測量1個數(shù)據(jù)，每個品種每一指標(biāo)共獲得90組數(shù)據(jù)。按以下公式［5］計算葉片中脈突起度(midrib protuberant degree，MPD):MPD=葉片中脈厚度/葉片厚度。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)比較

供試61個油茶品種葉片橫切面的解剖結(jié)構(gòu)及各指標(biāo)的測量數(shù)據(jù)見圖版Ⅰ和表1;葉片中脈橫切面的解剖結(jié)構(gòu)及各指標(biāo)的測量數(shù)據(jù)見圖版Ⅱ和表2;部分品種葉肉組織中晶體和石細(xì)胞形態(tài)見圖版Ⅲ。

表1 不同油茶品種葉片橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 1 Comparison of anatomical characteristics of leaf transection of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

表1 不同油茶品種葉片橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 1 Comparison of anatomical characteristics of leaf transection of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

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續(xù)表1 Table 1(Continued)

2.1.1 葉片橫切面(除中脈)解剖特征分析 從表1和圖版Ⅰ可以看出:供試的61個油茶品種葉片(除中脈外)橫切面均由上表皮和下表皮以及柵欄組織和海綿組織構(gòu)成，葉片多為典型的異面葉。

油茶葉片的上表皮和下表皮均由1層排列緊密的近方形扁平細(xì)胞組成，上表皮厚度為19.00～36.18 μm，下表皮厚度為14.05 ～35.45 μm，大多數(shù)油茶品種葉片上表皮的厚度大于下表皮;有表皮毛;上表皮和下表皮均被角質(zhì)層，且均在中脈處有所加厚;供試61 個品種的葉片厚度為 401.13 ～729.68 μm。柵欄組織由2～4層長柱形細(xì)胞組成，排列緊密，細(xì)胞層數(shù)多為3～4 層，厚度為116.8 ～271.3 μm;海綿組織細(xì)胞形狀多為橢圓形，排列較疏松，細(xì)胞間隙較大，厚度為198.2～518.4 μm。柵欄組織厚度與海綿組織厚度的比值為0.225～1.013，葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度為38.8% ～89.5%，葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度為17.2% ～44.6%。差異顯著性分析結(jié)果表明:上述各指標(biāo)在供試61個油茶品種間均存在顯著差異(P＜0.05)。

另外，在大部分葉片組織中含有石細(xì)胞和晶體。石細(xì)胞多集中在葉脈附近，晶體散布在海綿組織的大細(xì)胞內(nèi)(圖版Ⅲ)。

2.1.2 葉片中脈橫切面解剖特征分析 從圖版Ⅱ可以看出:葉片中脈在葉片的上表皮和下表皮處均形成突起，中脈由厚角組織、維管束和維管束鞘組成。厚角組織由大而圓的薄壁細(xì)胞構(gòu)成;維管束呈扇形，維管束鞘由2層薄壁細(xì)胞組成。維管束包含木質(zhì)部、韌皮部和形成層3部分;木質(zhì)部位于近軸端，韌皮部位于遠(yuǎn)軸端，且木質(zhì)部多于韌皮部。

由表2可見:油茶葉片的中脈厚度為532.6～1 317.8 μm，其中，木質(zhì)部厚度 116.1 ～364.2 μm，韌皮部厚度 40.0 ～181.8 μm。維管束短徑 171.8 ～529.5 μm，中脈突起度為 1.029 ～2.041，韌皮部厚度與維管束短徑比為0.197～0.431，木質(zhì)部厚度與維管束短徑比為0.578～0.797，維管束短徑與中脈厚度比為0.253～0.659。差異顯著性分析結(jié)果表明:上述各指標(biāo)在供試61個油茶品種間差異顯著(P＜0.05)。

表2 不同油茶品種葉片中脈橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 2 Comparison of anatomical characteristics of midrib transection of leaf of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

表2 不同油茶品種葉片中脈橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 2 Comparison of anatomical characteristics of midrib transection of leaf of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

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續(xù)表2 Table 2(Continued)

2.2 基于葉橫切面解剖學(xué)性狀的聚類分析

基于葉片及中脈橫切面解剖結(jié)構(gòu)特征對供試的61個油茶品種進(jìn)行聚類分析，其聚類分析的樹狀圖見圖1。

聚類分析結(jié)果顯示:基于葉片和中脈橫切面解剖結(jié)構(gòu)特征，可將供試的61個油茶品種分為13個組，其中，品種‘dy46’、‘長林 27號’、‘長林 21號’、‘fy7’、‘hy114’、‘dy156’、‘湘 5’、‘長林 91 號’、‘長林185號’和‘長林219號’分別單獨(dú)成組(分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ組);品種‘hy1’和‘hy17’聚為一組(Ⅺ組);品種‘長林15號’、‘長林81號’、‘長林 90號’、‘長林 94號’、‘長林 145號’和‘長林152號’聚為一組(Ⅻ組);供試的其他43個油茶品種聚為一組(ⅩⅢ組)。

圖1 基于葉片橫切面解剖特征的61個油茶品種的聚類圖Fig.1 Cluster dendrogram of 61 cultivars of Camellia oleifera Abel based on anatomical characteristics of leaf transection

2.3 分類檢索表

為便于油茶品種的鑒定和評估，綜合油茶品種葉片解剖特征的觀察結(jié)果，對聚類分析劃分的13個組編制相應(yīng)的分類檢索表:

基于葉片橫切面解剖特征的13組油茶品種的分類檢索表

3 討 論

3.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異分析

供試61個油茶品種中，長林系列品種是從來源不同的野生油茶上通過嫁接獲得的品種，而紅花油茶系列品種以及湘林、贛、桂無、桐、亞家、閩優(yōu)系列品種均代表來自不同地區(qū)的油茶品種。它們在葉片解剖結(jié)構(gòu)上具有不同特征，具體表現(xiàn)在以下幾個方面:

1)表皮厚度:不同油茶品種間上、下表皮厚度的變異幅度較大。其中，品種‘長林91號’葉片上表皮厚度和下表皮厚度都較薄，說明該品種抗寒能力較弱;品種‘長林27號’上、下表皮厚度都較厚，說明該品種抗寒能力較強(qiáng)，且其中脈突起程度明顯，也是其抗寒能力較強(qiáng)的佐證之一［6］。

2)葉片和中脈厚度:不同品種間葉片和中脈厚度變幅較大。其中，‘長林219號’、‘fy7’和‘hy114’中脈較厚，‘長林97號’、‘長林87號’和‘長林96號’中脈厚度較小;‘長林15號’、‘fy7’和‘hy114’葉片較厚，‘長林96號’、‘長林97號’和‘長林89號’葉片較薄，可以看出葉片厚度與中脈厚度呈一定的正相關(guān)關(guān)系?！L林219號’和‘hy114’的中脈突起度相對較大，‘長林96號’和‘長林97號’的中脈突起度相對較小，說明中脈突起度與葉片厚度、中脈厚度有一定的正相關(guān)關(guān)系。中脈突起度與葉片水分運(yùn)輸有關(guān)，所以紅花油茶系列品種的耐旱性較強(qiáng)。

3)葉肉組織結(jié)構(gòu):不同品種的柵欄組織和海綿組織厚度變幅均較大，其中海綿組織厚度變幅大于柵欄組織厚度;由此也導(dǎo)致葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度和緊密度變異較大。其中，‘長林162號’和‘長林82號’的葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度較大，‘dy156’、‘fy7’、‘hy114’、‘hy17’和‘hy1’葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度較小，但它們的中脈突起度都比較大，說明紅花油茶系列品種葉片柵欄組織不是很發(fā)達(dá)，光合效率不高且耐寒性弱［7］。

3.2 油茶耐寒性與葉解剖結(jié)構(gòu)的關(guān)系分析

基于前期關(guān)于耐寒性的研究結(jié)果，結(jié)合葉片解剖結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，可以認(rèn)為:葉片厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度和疏松度等指標(biāo)與油茶的抗寒性關(guān)系不大，而葉片上表皮厚度、氣孔密度和中脈突起度等指標(biāo)與抗寒性關(guān)系密切;氣孔密度小、葉表皮厚且中脈突起度大，則抗寒性強(qiáng);反之則抗寒性弱［8］。

3.3 油茶品種間親緣關(guān)系的分析

通過聚類分析可將供試的61個油茶品種分為13個組，其中，閩優(yōu)系列品種均來自福建，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。‘hy1’與‘hy17’同為紅花油茶系列，表現(xiàn)出一定的相似性。另外，不同的分組具有各自的顯著特征，如:組Ⅱ、組Ⅶ和組Ⅹ品種的中脈突起度與其他分組差異較明顯;組Ⅲ和組Ⅻ品種的韌皮部厚度與其他分組差異較明顯;組Ⅳ品種在葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度上與其他分組差異較明顯;組Ⅴ品種在葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度上與其他分組有明顯差異;組Ⅸ品種在維管束短徑長度上與其他分組差異明顯。

因此，油茶葉的解剖學(xué)特征可作為區(qū)分種或品種的依據(jù)，對種間親緣關(guān)系探討具有一定意義。

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