大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測(cè)與耐藥率的研究

李瑞華，曲 杰，王 寧

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測(cè)與耐藥率的研究

李瑞華1，曲 杰1，王 寧2

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

目的通過檢測(cè)大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因及細(xì)菌耐藥率，探討兩者間的關(guān)系。方法篩選ESBLs陽性菌株88例，通過多重PCR方法檢測(cè)ChuA, YjaA 和 TspE4.C2基因；應(yīng)用Vitek2 compact細(xì)菌自動(dòng)鑒定及藥敏分析儀檢測(cè)細(xì)菌耐藥率。結(jié)果大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群以D群57.95%為主，其余依次為A群20.45%、B2群14.78%、B1群6.82%。其中在痰標(biāo)本中檢出率A群、D群比例基本相當(dāng)，但在其他標(biāo)本中均以D群為主。B2群耐藥率顯著高于A群、D群(除外LEV)分離的菌株(P<0.05)。結(jié)論根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測(cè)，大腸埃希菌主要為D群為主，其次分別為A、B2、B1群。不同的系統(tǒng)發(fā)育群所表現(xiàn)的耐藥性不同，其中毒力最強(qiáng)的B2群耐藥率最高。

大腸埃希菌；系統(tǒng)發(fā)育群； ChuA；YjaA；TspE4.C2

大腸埃希菌是臨床常見的條件致病菌，也是醫(yī)院感染常見的病原菌。隨著抗生素的廣泛使用，大腸埃希菌的耐藥問題更加嚴(yán)峻。其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)成為最常見的耐藥機(jī)制，其可在不同菌群、菌株之間水平傳遞，常引起院內(nèi)感染的暴發(fā)流行[1]。因此，對(duì)于ESBLs陽性菌耐藥性的深入研究對(duì)指導(dǎo)臨床用藥十分重要。大腸埃希菌根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育群的研究，可分為A、B1、B2、D 4群[2]。不同的系統(tǒng)發(fā)育群所表現(xiàn)的致病能力也不同，其中，毒力最強(qiáng)的是B2群，其次是D群[3]。本研究對(duì)臨床分離出來的88例ESBLs陽性的大腸埃希菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育群和耐藥率的檢測(cè)，以了解其耐藥性與發(fā)育群的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2012年4月—12月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床分離出的88株ESBLs陽性大腸埃希菌，剔除重復(fù)菌株。標(biāo)本來自患者痰液(13株)，尿液(35株)，血液(18株)，胸、腹水(3株)，膿汁(6株)，膽汁(7株)，分泌物(2株)，穿刺液(4株)等。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株：陰溝腸桿菌ATCC700323;大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要儀器及試劑

細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)判定由VITEK 2 compact 型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)完成，藥敏折點(diǎn)使用CLSI 2012年判定標(biāo)準(zhǔn)。引物由大連寶生物工程有限公司合成；PCR反應(yīng)由天根生化科技有限公司研制的一管便攜式PCRMastermix完成。

1.3 DNA的提取

煮沸法提取細(xì)菌DNA做為模板。

1.4 多重PCR擴(kuò)增

用多重PCR法檢測(cè)88株細(xì)菌中的系統(tǒng)發(fā)育群基因，引物設(shè)計(jì)及產(chǎn)物判斷參見文獻(xiàn)[2]，所用引物見表1。

表1 ChuA、YjaA、TspE4.C2基因的引物

PCR檢測(cè)發(fā)育群基因反應(yīng)體系：反應(yīng)體系共25 μL。反應(yīng)液12.5 μL,每條引物各1 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃×5 min; 共30個(gè)循環(huán):94℃×30 s，55℃×30 s，72℃×30 s，最后延伸72℃×7 min。

PCR產(chǎn)物電泳： 2%瓊脂糖50 mL+1 μL溴化乙錠，100 V，穩(wěn)壓電泳20～30 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照閱讀結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳凝膠成像結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳凝膠成像，其中ChuA在279 bp，YjaA在211 bp，TspE4.C2在152 bp處出現(xiàn)清晰條帶。通過對(duì)基因條帶的分析來確定屬于A群、D群、B2群、B1群。見圖1。

2.2 大腸埃希菌檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)育群結(jié)果

比例最大的是D群為57.95%，其余依次為A群(20.45%)、B2群(14.78%)、B1群(6.82%)。通過分析大腸埃希菌主要來源可以看出，在痰標(biāo)本中A群、D群相等，其余標(biāo)本中均以D群為主。見表2。

圖1部分?jǐn)y帶ChuA、YjaA、TspE4.C2基因菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig 1 Partial electrophoretic result of ChuA, YjaA and TspE4.C2

1為A群；2,3,6為D群；5為B2群；7為B1群；4為Marker

M：DL2000TM,DNA Marker 1：groupA；2,3,6：groupD；5：groupB2；7：group B1

2.3 系統(tǒng)發(fā)育群與常用抗生素耐藥率關(guān)系

大腸埃希菌ESBL陽性株對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率為零；對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因的耐藥率較低；但是，對(duì)頭孢呋辛、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率達(dá)到了85%以上。

其中屬于B2群的大腸埃希菌對(duì)于左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶的耐藥率顯著高于A群、D群(除外LEV)分離的菌株，差異有顯著性意義(P<0.05)。見表3。

表2 大腸埃希菌按主要來源系統(tǒng)發(fā)育群比例

表3 系統(tǒng)發(fā)育群與藥物耐藥率比較

1)與A群、D群耐藥率比較，P<0.05

CAZ：頭孢他啶；TZP:哌拉西林/他唑巴坦；AK：阿米卡星；LEV：左氧氟沙星；F：呋喃妥因；CIP：環(huán)丙沙星

3 討 論

大腸埃希菌根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育群可以分為A、B1、B2、D 4群。對(duì)于系統(tǒng)發(fā)育群的檢測(cè)有以下幾種方法，脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)，多基因酶促電泳[4]等，但是這些方法費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。后來，Clermont等[5]通過標(biāo)記3個(gè)目的基因ChuA, YjaA 和 TspE4.C2，以簡(jiǎn)便的方法檢測(cè)出系統(tǒng)發(fā)育群。ChuA腸出血性大腸埃希菌O157：H7中血紅素運(yùn)輸所需的基因；YjaA是通過基因組序列在K-12大腸埃希菌中被確定的基因，其功能還不完全了解；TspE4.C2是消減文庫中的匿名的DNA片段。本研究按照此種方法進(jìn)行檢測(cè)，選取3種目的基因以PCR方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，再通過瓊脂糖凝膠電泳，分別在152 bp,211 bp,279 bp處呈現(xiàn)出3條清晰的條帶，其中D群只在279 bp處出現(xiàn)1條條帶，或伴152 bp處有條帶；B2群會(huì)在279 bp,211 bp處出現(xiàn)兩條條帶，或伴152 bp處有條帶；B1群在279 bp、211 bp處沒有條帶，在152 bp處有1條帶；而A群在279 bp、152 bp、211 bp處均不會(huì)出現(xiàn)條帶或僅在279 bp處有條帶，這樣就可以清晰地分析出各個(gè)系統(tǒng)發(fā)育群。

文獻(xiàn)顯示不同的地區(qū)各個(gè)系統(tǒng)發(fā)育群所占的比例可不同，Saira Bashir等[6]通過對(duì)巴基斯坦地區(qū)的研究指出所占比例最高的為B2群，其次為D群。黎曉強(qiáng)等[3]對(duì)廣州地區(qū)系統(tǒng)發(fā)育群的研究表明D群為主要部分。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群以D群57.95%為主，其余依次為A群(20.45%)、B2群(14.78%)、B1群(6.82%)。通過對(duì)大腸埃希菌主要來源的分析可以發(fā)現(xiàn)，血、尿標(biāo)本中都以D群為主，痰液標(biāo)本中D群、A群比例相差不大，說明目前大連地區(qū)大腸埃希菌主要系統(tǒng)發(fā)育群可能以D群為主。

產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌在臨床分離率達(dá)到60%～68.8%[7-8]，對(duì)于其耐藥性的深入研究具有一定的代表性。本研究所選的大腸埃希菌為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)陽性菌株，均對(duì)頭孢曲松耐藥，通過對(duì)其耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，大部分抗生素的耐藥率在50%以上，但對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亞胺培南和美羅培南高度敏感。故碳青霉烯類抗菌藥物可作為首選的治療藥物，用于治療重大感染；其次可以選用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物及阿米卡星。但是阿米卡星具有一定的腎毒性，在用藥時(shí)應(yīng)注意。頭孢替坦、頭孢吡肟也有很好的治療效果。其他類藥物均呈現(xiàn)不同程度耐藥，臨床治療時(shí)應(yīng)避免使用。

不同的系統(tǒng)發(fā)育群所具有的毒力因子不同，有報(bào)道指出毒力最強(qiáng)的是B2群，可以檢測(cè)出3個(gè)或以上毒力因子，其次是D群可以檢測(cè)出2～3個(gè)毒力因子[3]。通過對(duì)系統(tǒng)發(fā)育群與耐藥率關(guān)系的分析可以得出，對(duì)于左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶4種藥物,B2群的耐藥率顯著高于A群、D群(除外LEV)(P<0.05)?？赡芘c其檢測(cè)出的毒力因子多于其他群有關(guān)。至于毒力因子與耐藥性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。因B1群數(shù)量較少，沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。另外此次試驗(yàn)由于菌株數(shù)量偏少，可能代表性不是很強(qiáng)，還需要試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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StudyofPhylogeneticgroupgenesanddrugresistanceofescherichiacoli

LIRui-hua1,QUJie1,WANGNing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China;2.LaboratoryMedicineInstitute,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo investigate and discuss the relation between the Phylogenetic Groups and drug resistance of Escherichia coli.MethodsA total of 88 strains Escherichia Coli of ESBLs producing were collected, which were isolated from the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University. The detection of Phylogenetic Groups gene: ChuA,YjaA and TspE4.C2 is through PCR-based assays and agarose gel electrophoresis. The drug resistance is completed by Vitek2 compact automatic identification of bacterial drug resistance analysis of systems.Results88 strains E. coli isolates majority belonged to phylogenetic group D (57.95%), where as 20.45% belonged to groups A, 6.82% belong to groups B1, and 14.78% to group B2. Among the bacterial strain which come from respiratory system,group A and group D are nearly equal, but the mainly group in other systems are group D. During these Phylogenetic Groups,the drug resistance of group B2 is the highest one.ConclusionThe major phylogenetic group of Escherichia Coli is group D, then group A, B2, B1. The drug resistance of group B2 is the highest one.

Escherichia coli; Phylogenetic Groups; ChuA; YjaA; TspE4.C2

10.11724/jdmu.2013.02.18

R978.11

A

1671-7295(2013)02-0167-03

李瑞華，曲杰，王寧. 大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測(cè)與耐藥率的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(2)：167-169，192.

李瑞華(1972-)，女，遼寧朝陽人，副主任技師，碩士。E-mail:lrhzyp2006@163.com

2012-12-21；

2013-03-09)