黃樹軍，陳禮光，肖永太，榮俊冬，黃 婷，何天友，鄭郁善，，*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福州 350002)

大明竹屬(Pleioblastus)隸屬竹亞科(Bambusoideae)，主要分布東南亞，目前已發(fā)表的學(xué)名有100余種，我國有20余種，零散分布，長江中下游居多［1］。該屬竹筍可食，但味苦，竹竿通直壁厚，可作毛筆桿、傘柄、支架等用。一些竹如川竹［P.simonii(Carriere)Naka］、大明竹［P.gramineus(Bcan)Nakai］等的形態(tài)優(yōu)美，被廣泛用于園林綠化及庭院景觀。該屬的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值越來越受人們關(guān)注。

竹類植物的生長發(fā)育規(guī)律都較為特殊，以花、果實(shí)等形態(tài)為主的傳統(tǒng)植物分類方法對(duì)竹子分類復(fù)雜困難，竹子分類不一［2-4］，在學(xué)術(shù)上頗有爭議［5］。隨現(xiàn)代分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在竹子分類及遺傳多樣性研究得到了廣泛應(yīng)用［6-11］，分子標(biāo)記可檢測部分竹種的基因差異，在分子水平上輔助分類［12］，助于解決分類爭議，對(duì)鑒定種質(zhì)資源起重要作用。近年來，常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP等。簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)是由Zietkiewicz提出，有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性［13-14］，其技術(shù)要求低，操作簡便，成本低，是構(gòu)建基因圖譜理想的分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于鑒定品種、分析遺傳多樣性、繪制指紋圖譜等研究領(lǐng)域［15-18］。目前大明竹屬的部分植物分類還存在爭議［19］，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)大明竹屬植物種間親緣關(guān)系的研究報(bào)道不多。本試驗(yàn)利用ISSR技術(shù)分析大明竹屬25個(gè)種的遺傳多樣性，并用引物構(gòu)建25個(gè)種的DNA數(shù)字指紋識(shí)別碼，為大明竹屬部分竹種分類提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

在福建農(nóng)林大學(xué)百竹園取大明竹屬25個(gè)種含變種的嫩竹葉，每種取樣3—5株，用放變色硅膠的冰壺干燥保鮮，并速帶回置于-80℃低溫保存，以備提取DNA。ISSR引物為哥倫比亞大學(xué)公布的100條中經(jīng)篩選對(duì)25個(gè)種具有較好多態(tài)性的18條(見表1)。25個(gè)竹種依次編號(hào)(1—25)為:長葉苦竹P.china f.hisauchii、大明竹 P.gramineus(Bean)Nakai、垂枝苦竹P.amarus(Keng)Keng f.var.pendulifolius S.Y.Chen、光籜苦竹 P.amarus(Keng)Keng f.var.subglabratus S.Y.Chen、慶元苦竹 P.qingyuanensis、白紋東根世 P.chino f.angustifolius、遂昌苦竹 P.suichangensis、白紋女竹 P.simonii f.albostriatus、硬頭苦竹 P.longifimbriatus S.Y.Chen、橙綠鞘苦竹 P.dokgyoamus、油苦竹 P.oleosus Wen、杭州苦竹 P.amarus var.(Keng)Keng f.var.hangzhouensis S.L.Chen et S.Y.Chen(accepted name)、苦竹 P.amarus(Keng)Keng f.、黃條金剛竹 P.kongosanensis f.aureostriaus、秋竹 P.gozadakensis Nakai、仙居苦竹 P.hsienchuensis Wen、云和苦竹 P.yunhoensis、斑苦竹 P.maculates(McClure)C.D.Chu et C.S.Chao、衢縣苦竹P.juxianensis Wen、華絲竹P.intermedius S.Y.Chen、麗水苦竹 P.maculosoides Wen、宜興苦竹 P.yixingensis S.L.Chen et、實(shí)心苦竹 P.longifimbriatus S.Y.Chen、螺節(jié)竹 P.graminens f.manstopiral、皺苦竹 P.rugatus Wen et S.Y.Chen。

1.2 主要試劑和儀器

l0×PCR Buffer、DNA ladder Marker、dNTPs Mixture(各2.5 mmol/L)、ISSR 引物、Taq DNA 聚合酶、RNA 酶、MgCl2、瓊脂糖(Agarose)等購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon);核酸染料Gold View購于上海賽百盛公司;液氮購于福建省福州市第二化工廠;乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)、三羥基氨基甲烷(Tris)、硼酸、溴酚藍(lán)、無水乙醇、蔗糖等為國產(chǎn)分析純。主要實(shí)驗(yàn)儀器為:圣歐國際有限公司的LabCycler PCR、上海培清科技有限公司的JS-680全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀、北京六一儀器廠DYY-8C電泳儀等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

大明竹屬DNA的提取采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒(Cat#BSCl3S1)，在含有Gold View核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為1×TBE，電泳電壓為5 V/cm，電泳時(shí)間30 min，并用凝膠成像分析儀檢測DNA的完整性。用紫外分光光度計(jì)測定DNA純度及濃度。顯示DNA質(zhì)量完好，條帶明亮清晰完整，純度合格，滿足試驗(yàn)要求，于-20℃冰箱保存。

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

查閱資料［20］，PCR 設(shè)定反應(yīng)體積 20 μL，40 ng 模板 DNA、0.5 μmol/L 引物、0.5 mmol/L dNTPs、2 μL 的10×PCR Buffer、1.0 U Taq DNA聚合酶、2.0 mmol/L Mg2+。篩選時(shí)所應(yīng)用的擴(kuò)增程序固定為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次，72℃延伸7 min，4℃結(jié)束。以大明竹DNA樣品為模板，利用UBC811引物優(yōu)化ISSR擴(kuò)增體系。以設(shè)定的原初體系為基礎(chǔ)，單因素設(shè)計(jì)不同梯度的Mg2+、Taq DNA、引物、dNTPs、模板DNA濃度，每次改變其中某一因素優(yōu)化其體系。

經(jīng)篩選，確定大明竹屬部分植物的ISSR-PCR反應(yīng)體系為20 μL體系:2 μL的l0×Buffer;0.15 mmol/L的dNTPs;0.5 μmol/L的引物;2.5 mmol/L 的 MgCl2;50 ng/20μL 的模板 DNA;1.0 U 的 Taq DNA 聚合酶;10.6 μL的滅菌ddH2O。其ISSR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次，72℃延伸7 min，4℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物檢測用1.5%瓊脂糖凝膠電泳1 h，電壓80 V，核酸染料染色，在紫外凝膠成像分析儀拍照觀察。

1.3.3 ISSR有效引物的篩選及反應(yīng)體系的檢驗(yàn)

用100條隨機(jī)引物對(duì)任意一份DNA樣品在優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序擴(kuò)增以篩選引物，引物需符合(1)條帶清晰，不模糊，不彌散;(2)空白中無或少假帶;(3)對(duì)所有樣品均有質(zhì)量好的條帶。最后，以25種竹子的DNA作為模版，用篩選的18條引物檢驗(yàn)有效引物及反應(yīng)體系(圖1)。

圖1 大明竹屬植物ISSR部分引物篩選圖Fig.1 Preliminary seletion of some ISSR primers on Pleioblastus

1.4 ISSR條帶分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

ISSR條帶分析結(jié)果的記錄過程，不能只依據(jù)帶的強(qiáng)弱取舍位點(diǎn)，位點(diǎn)的帶應(yīng)具較好的可重復(fù)性，對(duì)弱帶的處理方式為:若重復(fù)性好，僅因升高退火溫度而消失，則視為退火位點(diǎn)不完全匹配造成，可記錄;而弱帶無規(guī)律可能為產(chǎn)物間退火、非專一性擴(kuò)增或其他人為因素導(dǎo)致，不可記錄。

采用Jaccard公式計(jì)算不同物種間隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA片段相似性:F=2Nxy/(Nx+Ny)，式中F為共享度，Nxy為物種X和物種Y共有的DNA片段數(shù)，Nx和Ny分別為物種X和物種Y的DNA片段數(shù)，任意兩物種間的遺傳距離(P)根據(jù)其共享的ISSR片段相似性D來計(jì)算，D=-lnF［21］。

ISSR擴(kuò)增帶用“1”和“0”表示有或無，建立數(shù)據(jù)庫。利用DPS 7.05軟件統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)遺傳距離(P)采用UPGMA類平均法進(jìn)行聚類分析，建立分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大明竹屬25種竹不同引物的ISSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用篩選的18條引物對(duì)25種竹ISSR分析，引物的堿基序列如表1所示。多態(tài)位點(diǎn)百分率是衡量一個(gè)群體內(nèi)遺傳變異水平高低的重要指標(biāo)，某群體的比值若高，則說明該群體的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng);反之則弱，經(jīng)長期進(jìn)化容易被淘汰。18條引物在供試樣品中共擴(kuò)增出155個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)137個(gè)，每個(gè)引物平均擴(kuò)增8.61個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)有7.61個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)占擴(kuò)增位點(diǎn)88.3%。說明大明竹屬種間有較大的遺傳差異，該屬作為一個(gè)群體具有強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。18條引物對(duì)25種竹共擴(kuò)增條帶1816條，每條引物平均擴(kuò)增條帶100.88條，部分引物擴(kuò)增如圖2—圖3所示。擴(kuò)增的DNA片段分子量在160—3000 bp之間。

表1 大明竹屬ISSR分析引物Table 1 The sequence of ISSR primers on Pleioblastus

圖2 引物U807對(duì)25個(gè)大明竹屬樣品的ISSR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 The 25 samples for Pleioblastus amplified by ISSR U807

圖3 引物U810對(duì)25個(gè)大明竹屬樣品的ISSR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 The 25 samples for Pleioblastus amplified by ISSR U810

2.2 大明竹屬部分竹類種間遺傳距離及遺傳多樣性分析

通過比較擴(kuò)增條帶有無、數(shù)量及帶型差異來分析種間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。差異條帶數(shù)量多，帶型變化大，說明竹種間的遺傳距離大，遺傳多樣性豐富，親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)，反之，遺傳距離就小，親緣關(guān)系則近。親緣關(guān)系可通過遺傳距離(0—1之間)來判定，若為1，則親緣關(guān)系完全一樣，若為0則無親緣關(guān)系。依據(jù)18條引物擴(kuò)增結(jié)果，量化基因組指紋圖譜為數(shù)據(jù)矩陣，用Jaccard公式計(jì)算種間的遺傳距離(表2)。大明竹屬25種竹的平均遺傳距離為0.5006，變異幅度在0.1486—0.7191之間，其遺傳距離的平均值及變異幅度均較高，說明大明竹屬具有較高的遺傳多樣性，表明該屬在遺傳進(jìn)化過程，受各類因素影響，或地理位置變遷，或氣候變化，種間的基因組DNA發(fā)生了變異，從而構(gòu)成豐富的基因庫。從DNA水平分析，若種間遺傳距離的變異幅度大，則說明其遺傳分化大，遺傳多樣性高，遺傳背景復(fù)雜，該屬的遺傳距離大多在0.5范圍內(nèi)，說明了該屬在遺傳上的相對(duì)穩(wěn)定性。表2可知同一竹種的變種的種間遺傳距離小，不同種的種間遺傳距離較大，大明竹亞屬中的長葉苦竹、大明竹、螺節(jié)竹與苦竹組有較大的遺傳距離，川竹亞屬苦竹組的種間遺傳距離小。種間遺傳距離顯示，大明竹屬25種竹的親緣關(guān)系與形態(tài)分類的分類結(jié)果基本一致，說明該形態(tài)分類方法比較合理，且用ISSR分析在分子水平檢測該屬部分植物的種間遺傳多樣性較為可靠。

2.3 大明竹屬25種竹的聚類分析

對(duì)擴(kuò)增結(jié)果形成的基因型原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用DPS 7.05軟件分析大明竹屬親緣關(guān)系，根據(jù)遺傳距離采用Nei_Li最長距離法聚類分析，建立聚類分析樹狀圖(圖4，表3)。

聚類結(jié)果表明:大明竹、長葉苦竹的遺傳距離最近0.1618，先聚為第一類;在0.3662處宜興苦竹、螺節(jié)竹聚為一起，并在0.4702處與麗水苦竹聚為第二類;在0.1618處同為苦竹變種的垂枝苦竹和光籜苦竹聚為一起，并在0.3665處與慶元苦竹聚為一枝;白紋東根世、白紋女竹在0.1750處聚在一起，并在0.3124處與遂昌苦竹聚為一枝;上述兩枝在0.4332處聚為一枝;在0.2113處硬頭苦竹、櫈綠鞘苦竹聚在一枝;在0.3319處，杭州苦竹、苦竹、黃條金剛竹、秋竹聚為一枝;在0.4286處實(shí)心苦竹與皺苦竹聚為一枝;在0.4337處，油苦竹、云和苦竹、衢縣苦竹、斑苦竹、華絲竹、仙居苦竹聚為一枝;以上幾枝最終在0.5396處合聚為第三類。在圖4畫線處(0.5396)可將25種竹劃分為3組，即第1組遺傳距離為0.1618:長葉苦竹和大明竹;第2組遺傳距離為0.4702:麗水苦竹、宜興苦竹及螺節(jié)竹;第3組遺傳距離為0.5634:垂枝苦竹、光籜苦竹、慶元苦竹、白紋東根世、白紋女竹、杭州苦竹、苦竹、硬頭苦竹、櫈綠鞘苦竹、黃條金剛竹、秋竹、云和苦竹、衢縣苦竹、斑苦竹、遂昌苦竹、華思竹、油苦竹、仙居苦竹、實(shí)心苦竹和皺苦竹。

圖4 25個(gè)大明竹屬竹種間的聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram of the cluster of 25 bamboo species of Pleioblastus based on ISSR markers

表3 大明竹屬植物個(gè)體的聚類次序及距離Table 3 Clutering order and genetic distance of the 25 bamboo species of Pleioblastus

2.4 大明竹屬25種竹基于ISSR技術(shù)的DNA數(shù)字指紋識(shí)別碼

研究得出用U807、U815及U835可鑒定大明竹屬25個(gè)竹種，還可與有較高多態(tài)性的U836、U840、U841和U844的4條引物共同構(gòu)建大明竹屬25種竹的DNA數(shù)字指紋識(shí)別碼(表4)，可用于鑒別大明竹屬部分竹類的分類。

3 結(jié)論與討論

研究共擴(kuò)增出重復(fù)性好的多態(tài)位點(diǎn)高達(dá)88.3%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增8.61個(gè)，DNA分子量在160—3000 bp，大明竹屬25種竹子的平均遺傳距離為0.5006，變異幅度為0.1486—0.7191，說明大明竹屬具有高的遺傳多樣性，種間遺傳相對(duì)復(fù)雜。ISSR聚類分析結(jié)果，在遺傳距離0.5396處將25種竹劃分為3類，與形態(tài)分類結(jié)果大致一致。第3組大多竹種的遺傳距離小于0.5(表3)，其表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳性狀，它們均為中國植物志傳統(tǒng)分類學(xué)的川竹亞屬苦竹組竹種，其中同為苦竹變種的垂枝苦竹和光籜苦竹在0.1618處相聚，苦竹和苦竹的變種杭州苦竹在0.1806處相聚，表現(xiàn)出較高的遺傳相似性。大明竹、長葉苦竹和螺節(jié)竹都為大明竹亞屬，和川竹亞屬苦竹組存在著較大的遺傳差異，其中大明竹和長葉苦竹親緣關(guān)系非常接近。楊光耀［22］用RAPD研究認(rèn)為，宜興苦竹與苦竹關(guān)系密切，大明竹與長葉苦竹、苦竹、斑苦竹、宜興苦竹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本研究則認(rèn)為大明竹與長葉苦竹關(guān)系密切，宜興苦竹與苦竹組未聚一起，與其觀點(diǎn)不一致。在傳統(tǒng)分類學(xué)中，麗水苦竹和宜興苦竹同屬于川竹亞屬苦竹組，但并未與苦竹組竹種相聚在一起，此結(jié)果有可能是因?yàn)橹穹N發(fā)生變異導(dǎo)致，或是人為因素促使，其具體原因及機(jī)理有待進(jìn)一步研究。雖然大明竹屬有些竹種未與其變種相聚在一起，劃分在其他亞屬里，但傳統(tǒng)形態(tài)分類與聚類分析結(jié)果大致吻合，說明ISSR分析大明竹屬部分竹類種間或種內(nèi)的親緣關(guān)系及遺傳多樣性較為精確可靠，有助于該屬的分類。試驗(yàn)結(jié)果多態(tài)性豐富，說明大明竹屬具有高的遺傳多樣性，其種間遺傳相對(duì)復(fù)雜，而ISSR技術(shù)能靈敏精確檢測多樣遺傳。試驗(yàn)用U807、U815、U835、U836、U840、U841、U844共7個(gè)引物建立大明竹屬25個(gè)竹種的數(shù)字指紋識(shí)別碼，為鑒定大明竹屬提供相應(yīng)依據(jù)。

表4 25個(gè)大明竹屬竹種的數(shù)字指紋碼Table 4 Fingerprints of the 25 provenances resources of Pleioblastus by ISSR

利用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子標(biāo)記等手段對(duì)竹類分類研究已有一定成果，但還存在較多分歧。分子標(biāo)記也具有一定的局限性，ISSR是繼SSR后發(fā)展的新技術(shù)，其重復(fù)性及穩(wěn)定性高，被廣泛用于分析遺傳多樣性及鑒定品種等方面。本研究利用ISSR技術(shù)對(duì)大明竹屬部分竹種初步探究，分子技術(shù)在竹類領(lǐng)域的研究還值得繼續(xù)探索。利用分子標(biāo)記開展竹種間分子水平上遺傳變異研究，結(jié)合形態(tài)分類，對(duì)竹類辨別分類，能夠更好地鑒定與解決某些種屬分類混亂問題，研究遺傳多樣性等，為竹子分類提供分子依據(jù)，使分類更加合理。隨生物技術(shù)不斷發(fā)展，竹類研究也將運(yùn)用生物技術(shù)解決更多難題，竹類的基因組研究、基因機(jī)理、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和克隆技術(shù)，都將成為竹類研究的新方向。

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