不同齲敏感兒童菌斑中變異鏈球菌數(shù)量及菌群比例的定量分析

趙河川　陳霄遲　徐韜

[摘要] 目的 比較不同齲敏感兒童口腔菌斑中變異鏈球菌數(shù)量及其在菌群中比例的差異。方法 采集26名3～4歲不同齲敏感的兒童牙面菌斑，運(yùn)用TaqMan探針實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測有齲組和無齲組兒童菌斑中變異鏈球菌和總菌數(shù)量，以及變異鏈球菌在總菌群中所占的比例，并對結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果 有齲組和無齲組兒童每毫克菌斑中變異鏈球菌菌落數(shù)分別為1.33×105、1.16×103 CFU·mg-1，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.033）；每毫克干重菌斑中總菌落數(shù)分別為7.17×107、1.01×108 CFU·mg-1，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.418）；有齲組和無齲組變異鏈球菌在總菌中所占比例分別為0.058 6和0.018 6，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008）。結(jié)論 無齲與患齲兒童牙面總菌群數(shù)量差異無顯著性，但患齲兒童牙面菌斑中變異鏈球菌數(shù)量更多，在總菌群中所占比例更大。提示菌斑中變異鏈球菌與總菌的比例與兒童患齲風(fēng)險密切相關(guān)，可以作為評估齲易感性和預(yù)測齲病發(fā)展趨勢的新指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 齲齒； 乳牙； 牙菌斑； 變異鏈球菌； 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號] R 781.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.018

乳牙齲是影響兒童口腔健康的主要疾病之一，變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是與乳牙齲關(guān)系最密切的致齲菌之一。林煥彩等[1]研究發(fā)現(xiàn)高齲兒童變異鏈球菌檢出率高于無齲兒童，菌斑致齲菌的種類越多，齲活躍性也就越高。支清蕙等[2]通過任意引物聚合酶鏈反應(yīng)（arbitrarily primed-polymerase chain reaction，AP-PCR）法驗(yàn)證了上述結(jié)果，推斷口腔中定植的變異鏈球菌是乳牙齲高發(fā)的危險因素。流行病學(xué)調(diào)查表明：齲活躍性分布不均，在發(fā)達(dá)國家學(xué)齡兒童中60%～70%齲發(fā)生在20%人群[3]。另外美國公共衛(wèi)生調(diào)查也顯示：1/4的學(xué)齡兒童擁有3/4的齲齒[4]。以往文獻(xiàn)[5-6]顯示兒童齲病不均衡性與變異鏈球菌數(shù)量密切相關(guān)。近期研究[7]表明口腔菌群是個復(fù)雜的微生物群落，菌種的多樣性和復(fù)雜性對齲齒的發(fā)生起著更重要的作用，提示變異鏈球菌在總菌群中的比例能更好地反映齲齒發(fā)生是多因素綜合作用的結(jié)果[8-10]。由此可見，兒童口腔中變異鏈球菌數(shù)量及與菌群比例的定量研究是了解齲齒高危人群和兒童齲病不均衡性的重要途徑。

本研究應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法對不同齲敏感兒童菌斑樣本進(jìn)行檢測，比較有齲和無齲兒童牙菌斑中變異鏈球菌數(shù)量、總菌量以及變異鏈球菌在總菌群中所占比例的差異，為從細(xì)菌水平上對乳牙齲齒的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測和預(yù)防提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Ingbritt（c）（首都醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供），TaqMan Universal PCR Master Mix、ABI 7500型定量PCR儀（Applied Biosy-stems公司，美國），溶菌酶、核糖核酸酶A（Merck公司，德國），桿菌肽（Amresco公司，美國），TYC Medium 培養(yǎng)基（Idgplc公司，英國），QIAamp DNA Mini Kit試劑盒（Qiagen公司，德國），Micro-Modulyo冷凍干燥機(jī)（Thermo Electron公司，美國），BioNano超微量紫外可見分光光度計（Thermo Scien-tific公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 研究對象 隨機(jī)抽取北京市海淀區(qū)某幼兒園小班學(xué)生26名，其中男14名，女12名。年齡3～4歲，平均年齡（3.7±0.3）歲。抽樣人群符合以下要求：采樣前2周內(nèi)未服用過抗生素類藥物，除齲齒外無其他口腔疾病及系統(tǒng)性疾病病史，采樣前2 h禁食，采樣期間除兒童日常刷牙外無其他特殊口腔健康措施實(shí)施。本研究經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象家長均知情同意。

1.2.2 口腔檢查 由1名口腔專業(yè)醫(yī)師擔(dān)任檢查者，在幼兒園現(xiàn)場采集齲病臨床數(shù)據(jù)。齲病檢查程序、器械和診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO口腔健康調(diào)查基本方法（3版）。檢查者經(jīng)第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組成員培訓(xùn)，統(tǒng)一齲病檢查方法和標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)Kappa>0.8，項目檢查前后檢查者自身標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)Kappa>0.9。1名經(jīng)培訓(xùn)的護(hù)士負(fù)責(zé)記錄數(shù)據(jù)，1 d內(nèi)完成兒童口腔齲病檢查。記錄齲失補(bǔ)牙面數(shù)（decayed missing filled surfaces，dmfs）。根據(jù)dmfs將受檢兒童分為無齲組（dmfs=0）和有齲組（dmfs≥1）。

1.2.3 樣本采集及處理 上午9：30-10：30采集菌斑樣本，無菌挖匙刮取上頜乳磨牙頰側(cè)完好牙面菌斑，轉(zhuǎn)移至裝有100 μL PBS（1×）液的EP管中（空管稱重為M0），常溫下8 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，重復(fù)離心一次后保留沉淀；用真空冷凍干燥機(jī)干燥沉淀1～2 h至水分完全揮發(fā)，然后稱取EP管+干菌斑的重量為M1，并計算出干菌斑重量M2（M2=M1-

M0）。處理完的樣本置于-20 ℃冰箱貯存。

1.2.4 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及細(xì)菌基因組DNA提取 向變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株梯度稀釋后樣本、菌斑樣本中加入裂解緩沖液，緩沖液包括20 mmol·L-1 Tris·HCl（pH 8.0）、2 mmol·L-1 乙二胺四乙酸（ethylene-diamine tetraacetic acid，EDTA）（pH 8.0）、1.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）。300 W超聲破碎，破2 s停1 s，循環(huán)30次；100 ℃水浴30 min，冷卻至室溫；再加入200 g·L-1溶菌酶，振蕩混勻后37 ℃恒溫水浴過夜。經(jīng)過預(yù)處理后的菌斑樣本按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒操作步驟提取基因組DNA。

1.2.5 DNA濃度測定 使用BioNano超微量紫外可見分光光度計測定10倍倍比稀釋的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣本總菌DNA濃度和純度。A260/A280為1.8～2.0，表明純度合格。根據(jù)測得的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度與循環(huán)閾值（Ct值）對應(yīng)關(guān)系，計算有齲組和無齲組變異鏈球菌濃度及其在總菌中所占比例。

1.2.6 引物及探針合成 變異鏈球菌特異性引物及探針和細(xì)菌通用引物及探針的設(shè)計參考文獻(xiàn)[6，11]。引物和TaqMan探針（5-FAM，3-TAMRA）均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，具體見表1。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR及產(chǎn)物分析 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇、純分和增菌后進(jìn)行10倍倍比稀釋，各稀釋濃度菌液分別進(jìn)行菌落培養(yǎng)計數(shù)及DNA提?。ㄒ?.2.4），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣本DNA在ABI 7500型定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，變異鏈球菌和總菌退火延伸溫度分別為60 ℃和68 ℃ 1 min，進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)試劑盒為Taq-Man Universal PCR Master Mix；反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）10 μL，正反引物（2 μmol·L-1）各2 μL，TaqMan探針（2.5 μmol·L-1）為2 μL，待測DNA模板為1 μL，ddH2O 3 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用卡方檢驗(yàn)比較有齲組和無齲組變異鏈球菌檢出率的差異；使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對有齲組和無齲組變異鏈球菌數(shù)量、總菌數(shù)量及變異鏈球菌占總菌數(shù)比例的差異進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落培養(yǎng)計數(shù) 選擇菌落數(shù)在30～300之間的培養(yǎng)皿計數(shù)。稀釋倍數(shù)為104、105、106的標(biāo)準(zhǔn)菌株液對應(yīng)的平均菌落數(shù)分別為280、27.7、2.7，可見連續(xù)3個10倍倍比稀釋濃度所對應(yīng)的菌落數(shù)也存在較好的10倍倍數(shù)關(guān)系。

2.1.2 變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增曲線 變異鏈球菌及陰性對照熒光定量PCR擴(kuò)增曲線見圖1。

2.1.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 在10～105稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Ct值與起始菌落數(shù)對數(shù)之間呈良好的線性關(guān)系（R2=0.988 2，斜率K=-0.244，截距B=9.950 3），證實(shí)了用Ct值進(jìn)行菌落定量的準(zhǔn)確性（圖2）。

2.2 菌斑樣本實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

2.2.1 基本情況 本實(shí)驗(yàn)26名兒童中患齲16人，無齲10人。兩組間性別比例和年齡分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

26份菌斑樣本中，有齲組和無齲組菌斑重量分別為（1.3±0.8）、（1.6±1.2） mg，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.370）；有齲組和無齲組總菌DNA濃度分別為（94.51±41.32）、（90.13±37.92） ng·μL-1，

二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.789）。

2.2.2 菌斑樣本實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果 應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR分別檢測26份菌斑樣本變異鏈球菌和總菌數(shù)量，有齲組和無齲組變異鏈球菌檢出率分別為93.8%和70.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.264）；每毫克干重菌斑中變異鏈球菌菌落數(shù)分別為1.33×105、1.16×103 CFU·mg-1，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=

0.033）；每毫克干重菌斑中總菌落數(shù)分別為7.17×107、1.01×108 CFU·mg-1，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=

0.418）；有齲組和無齲組變異鏈球菌在總菌中所占比例分別為0.058 6和0.018 6，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008）。

3 討論

唾液中變異鏈球菌的數(shù)量可作為齲活躍性評估以及齲病狀態(tài)檢測的指標(biāo)[5，8，12-13]。變異鏈球菌存在于直接黏附在牙面上的菌斑中，用菌斑中變異鏈球菌水平對患齲風(fēng)險進(jìn)行評估更為直接和準(zhǔn)確[14]。牙冠不同部位菌斑微生物組成不同，齲壞區(qū)域內(nèi)的變異鏈球菌數(shù)目明顯增多，尤其在齲表層的變異鏈球菌的比例最高[15]。為了避免齲壞組織對菌斑中變異鏈球菌檢出數(shù)量的影響，本研究選擇從雙側(cè)上頜乳磨牙頰側(cè)完好牙面采集菌斑。另外，以往研究通過菌斑濕重來衡量單位重量菌斑中變異鏈球菌數(shù)量的方法存在弊端，比如描述菌斑重量時使用約數(shù)不準(zhǔn)確，菌斑中水分含量對結(jié)果的影響等。為了減少這方面誤差，本研究對菌斑樣本進(jìn)行了真空干燥處理，排除了水分重量影響，檢測結(jié)果以每毫克干重菌斑中細(xì)菌量來表示，減少液體干擾因素。

本研究結(jié)果表明：1）有齲組和無齲組兒童菌斑中變異鏈球菌檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與其他研究[8，16]結(jié)果相似，說明變異鏈球菌是人口腔條件致病微生物，其存在并不是齲發(fā)生的必然因素。Choi等[9]通過實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)無齲兒童菌斑中變異鏈球菌檢出率為80%，有齲兒童變異鏈球菌檢出率則為100%，本研究中變異鏈球菌檢出率在數(shù)值上略低于Choi等[9]的報道，分析原因可能為Choi等[9]研究的樣本人群年齡較本研究偏大（5～6歲），推測變異鏈球菌在學(xué)齡前組人群口腔內(nèi)定植或口腔內(nèi)變異鏈球菌數(shù)量多于幼兒組人群，導(dǎo)致檢出率增高。2）有齲組和無齲組每毫克干重菌斑中變異鏈球菌菌落數(shù)有顯著性差異（P=0.033）。Yoshida等[6]通過TaqMan熒光定量PCR檢測菌斑樣本中變異鏈球菌數(shù)量為0～4.82×106 CFU·mg-1（濕重菌斑），略高于本研究。Yoshida等[6]的研究中未記錄樣本人群口腔dmfs狀況。Choi等[9]的研究表明齲均大的個體，菌斑中變異鏈球菌計數(shù)高，在總菌中比例高。3）有齲組和無齲組每毫克干重菌斑中總菌落數(shù)、菌群DNA濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測有齲和無齲兒童菌斑中總細(xì)菌數(shù)量差別不大，但由于菌種構(gòu)成比例不同，菌種間存在互相拮抗抑制或者協(xié)同促進(jìn)，從而對齲活躍性產(chǎn)生不同的影響。4）近年來有學(xué)者開始研究各菌群間比例與患齲風(fēng)險之間的關(guān)系，而不僅是關(guān)注致齲菌的絕對數(shù)量。Hata等[10]研究發(fā)現(xiàn)3～4歲兒童菌斑中變異鏈球菌與總菌的比例為0.01～0.058，并提出齲病的發(fā)生與變異鏈球菌在總菌中所占比例密切相關(guān)。Yoshida等[6]研究結(jié)果表明變異鏈球菌在總菌中所占比例為0～0.072。本研究中有齲組和無齲組變異鏈球菌在總菌中所占比例分別為0.058 6和0.018 6，與上述兩研究結(jié)果基本相近。并且二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008），說明至少在本組人群中變異鏈球菌與總菌的比例比變異鏈球菌檢出率能更好地反映齲的活躍性，對齲齒易感人群的評估、齲病的預(yù)防和早期干預(yù)有較高的應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果表明，TaqMan探針熒光定量PCR能高效、靈敏、準(zhǔn)確地檢測變異鏈球菌和總菌數(shù)量；不同齲敏感兒童菌斑中變異鏈球菌及其與總菌的比例存在差異；變異鏈球菌在總菌群中所占比例與患齲風(fēng)險密切相關(guān)，在評估齲易感性方面有重要意義。

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（本文編輯 杜冰）