馬 玲 苑龍條 劉 翼

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是育齡期婦女不孕的常見原因，發(fā)病率高達(dá)6%～8%，以高雄激素血癥和無排卵為主要特征。研究資料表明，胰島素抵抗、瘦素和脂聯(lián)素與PCOS的發(fā)病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用Poresky法誘導(dǎo)PCOS動(dòng)物模型，通過觀察藥物干預(yù)后PCOS大鼠的體重、胰島素敏感性指數(shù)(IRI)、血清瘦素和脂聯(lián)素水平的變化，以探討小檗堿對PCOS大鼠生殖內(nèi)分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性清潔級SD大鼠64只，24天齡，體重150～160 g，山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。在20℃～22℃、濕度 60%的清潔動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 藥物和試劑

鹽酸小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所，鹽酸二甲雙胍片購自天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司新新制藥廠。注射用人絨毛膜促性腺激素(HCG)：上海天呈科技有限公司產(chǎn)品；胰島素注射液：諾和諾德(中國)制藥有限公司產(chǎn)品；微量血糖測定儀(配套血糖試紙)：美國強(qiáng)生公司產(chǎn)品；胰島素放免盒：北京原子能生物研究所產(chǎn)品；脂聯(lián)素、瘦素Elisa試劑盒：深圳依諾金生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 PCOS大鼠模型制備及分組

64只大鼠隨機(jī)分為正常對照組17只、模型組47只。采用Poresky法進(jìn)行造模，每只大鼠皮下注射HCG 1.5 U,Bid×22 d; 同時(shí)第1～11天皮下注射精蛋白鋅重組人胰島素注射液,自0.5 U/d起逐漸遞增至6.0 U/d,且按此劑量維持至第22天,正常對照組則皮下注射等量生理鹽水22天，各組同條件喂養(yǎng)。第23天隨機(jī)選擇正常對照組和模型組大鼠各2只，處死后取卵巢切片，以評價(jià)造模是否成功。鏡下觀察正常對照組中卵巢組織中卵泡數(shù)目較少，并可見成熟卵泡和黃體；模型組卵巢組織內(nèi)均可見卵巢囊性改變，卵泡囊性擴(kuò)張，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，排列疏松，膜間質(zhì)細(xì)胞增生提示造模成功。模型組大鼠隨機(jī)分為模型對照組、二甲雙胍組和小檗堿組，每組15只。

1.4 給藥方法

灌胃法給藥21天。給藥劑量：按動(dòng)物體重折算系數(shù)公式換算，小檗堿組以小檗堿每天190 mg/kg灌胃；二甲雙胍組以二甲雙胍每天160 mg/kg進(jìn)行灌胃；正常對照組和模型對照組每天給予同體積蒸餾水灌胃，均為每天1次，連續(xù)21天。

1.5 檢測方法和項(xiàng)目

1.5.1 體重、空腹血糖和空腹胰島素的測定 用藥結(jié)束后，禁食水24 h，測定每只大鼠的體重。取尾靜脈血，采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖,胰島素采用放免法測定,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。按以下公式計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI),ISI=Ln〔1/(FBG·FIns)〕。

1.5.2 瘦素、脂聯(lián)素的測定 各組大鼠處死后，用戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部剪毛，常規(guī)消毒，打開胸腹腔，心臟取血，3 000 r/min離心，分離血清，-20℃保存，采用Elisa法測定瘦素和脂聯(lián)素，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

表1 各組大鼠體重、胰島素敏感指數(shù)、瘦素及脂聯(lián)素水平的比較

a為與正常對照組比較，P<0.05；b為與模型對照組比較，P<0.05；與二甲雙胍組比較，d為P<0.05,c為P>0.05

由表1可見，模型對照組體重、胰島素敏感指數(shù)、血清瘦素水平均較正常對照組明顯升高(P<0.05)，脂聯(lián)素水平明顯下降(P<0.05)；小檗堿組和二甲雙胍組體重、胰島素敏感指數(shù)、血清瘦素水平均較模型對照組明顯下降(P<0.05)，脂聯(lián)素水平明顯升高(P<0.05)；與二甲雙胍組相比，小檗堿組體重、胰島素敏感指數(shù)、血清瘦素水平無顯著性差異(P>0.05)，但脂聯(lián)素水平明顯升高(P<0.05)。

3 討論

多囊卵巢綜合征是育齡婦女常見的難治性內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，今年來許多研究資料表明，除了以高雄激素血癥為突出表現(xiàn)外，PCOS患者還存在著許多方面的代謝異常，其中胰島素抵抗在PCOS發(fā)病中扮演著重要角色，約50%～70%的PCOS均存在不同程度胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。與年齡、體重相匹配的非PCOS人群相比，PCOS患者發(fā)生Ⅱ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加5～10倍，她們早在30歲就可能進(jìn)展到糖耐量損害或Ⅱ型糖尿病[1]。而脂肪因子如瘦素、脂聯(lián)素可通過代謝-神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)參與胰島素抵抗的病理過程，對PCOS患者IR的形成可能起著重要作用。

瘦素是肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)，它是由167個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽，它的作用主要是調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪和質(zhì)量穩(wěn)態(tài)，還可作用于下丘腦-垂體-性腺軸。調(diào)節(jié)生殖功能，對青春期的啟動(dòng)、生長發(fā)育和生殖等過程意義重大。Atamer等[2]研究顯示，在PCOS患者中，無論肥胖與否，其血清瘦素濃度顯著高于相同BMI的正常排卵周期婦女。瘦素水平異常與PCOS患者發(fā)生不排卵的情況密切相關(guān)，Li等[3]對110例不孕患者研究發(fā)現(xiàn)，PCOS組血清和卵泡液瘦素濃度明顯高于對照組。這說明卵巢局部的高瘦素血癥很可能是PCOS不孕的一個(gè)病理因素。Yoon等[4]研究發(fā)現(xiàn)瘦素及其受體在子宮內(nèi)膜著床部位與非著床部位上表達(dá)明顯不同，認(rèn)為瘦素及其受體系統(tǒng)可能直接參與了胚胎著床過程。

脂聯(lián)素是近年來發(fā)現(xiàn)的唯一由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，在預(yù)防和對抗IR方面有重要的作用。研究資料表明脂聯(lián)素在PCOS一系列代謝、內(nèi)分泌紊亂中起重要作用[5,6]，是聯(lián)系脂代謝和生殖功能的重要信號因子和敏感指標(biāo)[7]。相關(guān)研究顯示，PCOS患者不論肥胖與否，普遍存在低脂聯(lián)素血癥，而肥胖的患者則血清脂聯(lián)素更低[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對照組較正常對照組體重、胰島素敏感指數(shù)、血清瘦素水平均明顯升高，脂聯(lián)素水平明顯降低，說明此動(dòng)物模型不僅在卵巢形態(tài)學(xué)方面與PCOS患者類似，在糖脂代謝方面也與PCOS患者相似，因此，該動(dòng)物模型適用于PCOS的相關(guān)研究。

Kong等[9]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有降血糖、糾正脂質(zhì)紊亂作用,并發(fā)現(xiàn)小檗堿能促進(jìn)葡萄糖在脂肪細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和消耗,抑制脂肪細(xì)胞分化的作用,因此，證實(shí)了小檗堿通過促進(jìn)外周組織利用葡萄糖而起降糖的作用。實(shí)驗(yàn)表明，小檗堿可以增強(qiáng)人類肝細(xì)胞HepG2胰島素受體的表達(dá)，肝細(xì)胞表面的胰島素受體表達(dá)增強(qiáng)直接增強(qiáng)肝細(xì)胞對胰島素的敏感性，通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)利用和吸收[10]。王秀秀等[11]在體外培養(yǎng)的胰島素抵抗卵巢模型的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，中藥小檗堿能降低卵巢的胰島素抵抗程度和雄激素合成。馬玉琨等[12]在PCOS合并胰島素抵抗的患者的臨床研究結(jié)果表明，對PCOS有效的治療藥物，能夠改善高胰島素血癥，調(diào)節(jié)血脂，減輕體重，具有良好的改善胰島素抵抗作用。本研究證明小檗堿可以降低PCOS大鼠模型的體重、增強(qiáng)其胰島素敏感性，降低血清瘦素水平，而且與二甲雙胍相比療效無顯著性差異，且小檗堿在升高PCOS大鼠模型血清脂聯(lián)素水平的效果優(yōu)于二甲雙胍，提示其應(yīng)用于臨床治療可能的優(yōu)勢所在。

綜上所述，小檗堿可能通過降低PCOS大鼠模型的體重、增強(qiáng)其胰島素敏感性、降低血清瘦素水平、升高血清脂聯(lián)素水平的途徑，來改善胰島素抵抗及脂代謝的異常，從而調(diào)節(jié)PCOS大鼠模型的內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖機(jī)能，其相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，都顯示小檗堿作為中藥胰島素增敏劑對治療PCOS將具有良好的應(yīng)用前景，但小檗堿的作用機(jī)理是多途徑、多角度、多靶點(diǎn)的,還有待于進(jìn)一步深入的研究，為臨床治療提供全面的依據(jù)。

[1] Ovalle F,Azziz R.Insulin resitance，polycystic ovarysyndr-ome and type 2 diabetes mellitus〔J〕.2002,77(6):1095.

[2] Atamer A,Demir B,Bayhan G,et al.Serum levels of leptin and homocysteine in women with polycystic ovary syndrome and its relationship to endocrine,clinical and metabolic parameters〔J〕.J Int Med Res,2008,36(1):96.

[3] Li M G,Ding G L,Chen X J,et al.Association of serum and follicular fluid leptin concentrations with granulosa cell phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 expression in fertile patients with polycystic ovarian syndrome〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2007,92(12):4771.

[4] Yoon S J,Cha K Y,Lee K A.Leptin receptors are down-regulated in uterine implantation sites compared to interimplantation sites〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2005,232(1-2):27.

[5] Yilmaz M,Bukan N,Demirci H,et al.Serum resistin and adiponectin levels in women with polycystic ovary syndrome〔J〕.Gynecol Endocrinol,2009,25(4):246.

[6] 張文娟，于新艷.多囊卵巢綜合征患者血清脂聯(lián)素水平及與胰島素抵抗相關(guān)性的研究〔J〕.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2008,17(2):113.

[7] 王勇軍，余 平.多囊卵巢綜合征患者血清內(nèi)脂素、脂聯(lián)素、瘦素的變化及臨床意義〔J〕.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,34(1):72.

[8] 陳友國，沈宗姬，胡建銘，等.脂聯(lián)素對多囊卵巢綜合征內(nèi)分泌代謝異常的影響〔J〕.江蘇醫(yī)藥,2006,32(2):114.

[9] Kong W,Wei J,Abidi P,et al.Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins〔J〕.Nat Med,2004,10(12):1344.

[10] Kong W J,Zhang H,Song D Q,et al.Berberine reduces insulin resistance through protein kinase C-dependent up-regulation of insulin receptor expression〔J〕.Metabolism,2009,58(1):109.

[11] 王秀秀，李 威，劉逸超，等.小檗堿對胰島素抵抗卵巢甾體激素體外合成和代謝的調(diào)控作用〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30(2):161.

[12] 馬玉琨，楊軍光，隋 明，等.小檗堿治療多囊卵巢綜合征合并胰島素抵抗療效研究〔J〕.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2011,27(9):684.