董萬(wàn)強(qiáng)， 姚 能， 徐慶剛

(江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院， 鎮(zhèn)江 212013)

由于HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶沒(méi)有轉(zhuǎn)錄校正能力，因此HIV-1基因具有很高的變異性。根據(jù)基因的不同，HIV-1分為M(主要組)、N(非M非O組)、O(外圍組)和P 4個(gè)組。其中，M組是導(dǎo)致全球艾滋病流行的主要組群[2]，其又可以進(jìn)一步分為11個(gè)亞型(包括A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K)，49個(gè)流行重組型(CRFs)和超過(guò)200個(gè)唯一重組型(URFs)。在亞洲流行的亞型主要有B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC。高變異性使得HIV-1能夠輕易地逃逸宿主免疫反應(yīng)和藥物壓力[3-5]。

Env 基因編碼表面膜蛋白Gp120和跨膜蛋白Gp41，在HIV-1基因組中突變率最高。Gp120不僅是病毒侵入宿主并與宿主細(xì)胞受體(CD4和CCR5或CXCR4)的結(jié)合位點(diǎn)，而且是宿主免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)[6-9]。Gp120包含5個(gè)高變區(qū)(V1-V5)和4個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域(C1-C4)[10]。在5個(gè)高變區(qū)中，V3區(qū)包含大約35個(gè)氨基酸并由2個(gè)半胱氨酸形成環(huán)形結(jié)構(gòu)連接。V3區(qū)直接決定病毒輔助受體類型(即細(xì)胞嗜性)[11-13]。而V1/V2和V4區(qū)，也會(huì)影響病毒輔助受體使用情況[14-16]。

同時(shí)，這幾個(gè)高變區(qū)也是中和抗體的重要靶點(diǎn)。V1/V2區(qū)的高變性增強(qiáng)了HIV-1逃逸免疫的能力[15,17-18]。V4和V5區(qū)參與CD4結(jié)合和自體免疫[19-20]。更重要的是，V1-V5區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的共同作用最大程度上加強(qiáng)了HIV-1病毒逃逸免疫的能力[5]。最新研究表明V1/V2區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性是B亞型HIV-1流行的主要原因，增加V1/V2區(qū)的長(zhǎng)度能夠提高B亞型病毒抵抗宿主免疫能力[21]。這些研究都表明HIV-1 Gp120的多態(tài)性和序列特征，尤其是5個(gè)高變區(qū)，在HIV-1發(fā)病機(jī)理和免疫逃逸中起到至關(guān)重要的作用。直接影響HIV-1疫苗研究的發(fā)展。

在本文中，我們下載了現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中記載的包括B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC 5種亞洲主要流行亞型的所有Gp120及其5個(gè)高變區(qū)序列，分析了HIV-1 Gp120及其5個(gè)高變區(qū)序列的長(zhǎng)度多態(tài)性，糖基化位點(diǎn)數(shù)以及序列特征。發(fā)現(xiàn)V3區(qū)表現(xiàn)出了最低的長(zhǎng)度多態(tài)性，最少的糖基化位點(diǎn)；V1和V4區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性較高，糖基化位點(diǎn)也較高。HIV-1 Gp120 高變區(qū)多態(tài)性的研究將為艾滋病疫苗的發(fā)展提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 序列收集和排序

從Los Alamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(Los Alamos National Laboratory, LANL)的HIV序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)下載了亞洲所有 HIV-1 Gp120 及其5個(gè)高變區(qū)序列，合計(jì)為19373條(包括亞型B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC)。這些序列按所屬區(qū)域和亞型的不同被分成30個(gè)序列群(見(jiàn)表1)。

表1 每個(gè)序列群的序列數(shù)目

表中每一個(gè)數(shù)字代表HIV-1特定亞型或重組型(B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC)的特定區(qū)域(Gp120、V1、V2、V3、V4和V5)的序列數(shù)量。

1.2 長(zhǎng)度多態(tài)性和序列特征分析

將表1中序列群轉(zhuǎn)換成蛋白序列后，我們統(tǒng)計(jì)了每條序列的長(zhǎng)度。使用MEGA4.0.2軟件中的Clustal W程序，比較了每個(gè)序列群的序列特征，包括每個(gè)位點(diǎn)特定氨基酸出現(xiàn)的頻率，然后根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高的氨基酸使用WEBLOGO軟件(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)做了序列l(wèi)ogo圖[22]。另外，由于V3區(qū)決定了HIV-1的輔助受體嗜性，所以我們對(duì)6個(gè)不同亞型的V3區(qū)一致序列進(jìn)行了比對(duì)，并使用HIV-1 PhenoPred(http://yjxy.ujs.edu.cn/R5-X4%20pred.rar)軟件預(yù)測(cè)了各一致序列的輔助受體嗜性[23]。

1.3 潛在糖基化位點(diǎn)分析

基于一個(gè)三肽Asn-Xaa-Ser/Thr預(yù)測(cè)為一個(gè)糖基化位點(diǎn)的原則，我們編寫(xiě)了一個(gè)小的程序用來(lái)統(tǒng)計(jì)所研究序列中的糖基化位點(diǎn)數(shù)量。其中，每條過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)的序列均被刪除。

2 結(jié)果

2.1 Gp120的長(zhǎng)度多態(tài)性分析

圖1A中展示了HIV-1不同亞型中Gp120的長(zhǎng)度多態(tài)性。亞型B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的Gp120有不同的長(zhǎng)度大小，分別為491～534、491～529、496～539、494～521和506～514個(gè)氨基酸。其中，CRF08_BC的100%序列長(zhǎng)度大小均集中在506～515個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)，表明它們的多態(tài)性較低。其它亞型則分布在更大的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。B′亞型75.96%和C亞型76.65%的序列分布在501～520個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。CRF01_AE的91.2%和CRF07_BC的94.49%分布在496～515個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。所以，在以上5種亞型和重組型中，B′和C有較高的Gp120長(zhǎng)度多態(tài)性，而CRF08_BC多態(tài)性相對(duì)較低(圖1A)。

2.2 Gp120 5個(gè)高變區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性分析

圖1B-F描述了Gp120 5個(gè)高變區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性特征。V1-V5的平均長(zhǎng)度大小分別為29(14～44)、43(31～57)、34(30～38)、31(18～44)和15(8～23)個(gè)氨基酸。除V3區(qū)外，不同亞型的其它高變區(qū)具有非常相似的長(zhǎng)度多態(tài)性。而大多數(shù)的的V3環(huán)(B′中88.3%、C中98.2%、CRF01_AE中96.7%、CRF07_BC中99.1%和CRF08_BC中100%)均有35個(gè)氨基酸。5個(gè)高變區(qū)的長(zhǎng)度分布表明V1、V2、V4和V5區(qū)具有更高的長(zhǎng)度多態(tài)性，而V3區(qū)在長(zhǎng)度上最保守(圖1B-F)。這也許是因?yàn)閂3環(huán)對(duì)HIV-1感染和發(fā)病機(jī)制的重要性造成的。

圖1 亞洲主要流行亞型HIV-1 Gp120和V1-V5區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性分析

A—Gp120；B—V1區(qū)；C—V2區(qū)；D—V3區(qū)；E—V4區(qū)；F—V5區(qū)。

進(jìn)一步對(duì)5種HIV-1亞型和重組型的V3區(qū)一致序列分析發(fā)現(xiàn)，除B′的13號(hào)位點(diǎn)(R/H)、18號(hào)位點(diǎn)(Q/R)和19號(hào)位點(diǎn)(T/A)的突變，以及CRF01_AE的5號(hào)位點(diǎn)(N/S)、10號(hào)位點(diǎn)(K/T)、13號(hào)位點(diǎn)(R/T)、19號(hào)位點(diǎn)(T/V)和22號(hào)位點(diǎn)(A/R)的突變外，它們有幾乎完全一致的序列(圖2)。驗(yàn)證了V3環(huán)的保守。已有研究表明V3區(qū)的11和25號(hào)位點(diǎn)的氨基酸從中性和/或酸性氨基酸到堿性氨基酸的轉(zhuǎn)變決定了HIV-1的輔助受體嗜性。本文用生物信息學(xué)軟件R5/X4-pred對(duì)這6個(gè)亞型的V3區(qū)一致序列的輔助受體嗜性進(jìn)行了分析[23]，分析結(jié)果顯示所有亞型和重組型均為R5嗜性。這不僅證實(shí)了我們以前研究的結(jié)論即大部分的亞型B′和C序列均屬于R5嗜性的觀點(diǎn)[24]，也反映出R5型菌株在HIV-1傳播和發(fā)病機(jī)理上占有非常關(guān)鍵的地位[25-26]。

圖2不同亞型V3區(qū)一致序列比對(duì)

其中“↑”表示決定HIV-1輔助受體嗜性的2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)。每條一致序列的輔助受體嗜性均用“HIV-1PhenoPred”軟件預(yù)測(cè)。

2.3 Gp120 5個(gè)高變區(qū)的潛在糖基化位點(diǎn)(PNGS)分析

HIV-1的Gp120是一個(gè)高糖基化蛋白，糖基化不僅僅參與Gp120的產(chǎn)生和形成，也參與Gp120免疫原性的降低，從而減少抗體中和反應(yīng)。本文對(duì)Gp120 5個(gè)高變區(qū)的潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)高變區(qū)的潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)不同(圖3A-E)。其中，86.5%～98.2%的V4區(qū)含有3～6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，在5個(gè)高變區(qū)中數(shù)量最多(圖3D)，而79.1%～96.1%的V3區(qū)只有1個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，在5個(gè)高變區(qū)中數(shù)量最少(圖3C)。另外，90.9%～97.5%的V5區(qū)含1～2個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(圖3E)，稍多于V3區(qū)。82.5%～100%的V1區(qū)和86.3%～100%的V2區(qū)含有2～4個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(圖3A和B)，比V4區(qū)要少。

圖3 HIV-1亞洲主要流行亞型的Gp120 V1-V5區(qū)中潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量分布圖

A—V1區(qū)；B—V2區(qū)；C—V3區(qū)；D—V4區(qū)；E—V5區(qū)。

2.4 Gp120 5個(gè)高變區(qū)的序列特征分析

為了描述V1-V5區(qū)的序列特征，我們繪制了每個(gè)高變區(qū)的序列LOGO圖。在每個(gè)高變區(qū)中，不同亞型不僅具有相似的保守序列，也有一些高度變化的序列(圖4)。這些高變區(qū)也許是不同亞型的遺傳變異導(dǎo)致的，顯示了與亞型相關(guān)的序列特征。尤其是V1和V4區(qū)比其他區(qū)變異更多，可能與這兩個(gè)區(qū)對(duì)HIV-1免疫逃避的重要性有關(guān)。V3區(qū)是最保守的高變區(qū)，與長(zhǎng)度多態(tài)性的分析一致(圖1)。幾乎所有的V3區(qū)中都有“GPGQ/R”基序。在V2和V5區(qū)，也分別發(fā)現(xiàn)同樣保守的基序“ALFY”和“ETFRP”。這些保守基序可能需要保持恒定從而正常發(fā)揮它們非常重要的功能。

圖4 亞洲主要流行亞型HIV-1 V1-V5區(qū)Logo圖

A—V1區(qū)；B—V2區(qū)；C—V3區(qū)；D—V4區(qū)；E—V5區(qū)。

3 討論

HIV-1 Gp120蛋白位于病毒表面，對(duì)病毒侵入宿主細(xì)胞起決定作用[11]。它是中和抗體的最重要的靶點(diǎn)[6-9]。Gp120的高度變異和高糖基化位點(diǎn)擁有率能通過(guò)不斷地改變抗原決定表位和降低抗原性增加AIDS疫苗研究的難度[5]。通過(guò)分析亞洲主要流行亞型的HIV-1 Gp120序列，我們發(fā)現(xiàn)大部分的HIV-1 Gp120含有496～515個(gè)氨基酸(圖1A)。這表明具有496～515個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的HIV-1 Gp120的毒株有助于疫苗研究。

在Gp120包含的5個(gè)高變區(qū)中，V3區(qū)是高度保守的區(qū)域，反映其功能的重要性[21,27]。首先，V3環(huán)是決定HIV-1細(xì)胞嗜性最重要的區(qū)域[26]，其次，V3環(huán)幾乎沒(méi)有糖基化位點(diǎn)，能更容易結(jié)合輔助受體(CCR5或者CXCR4)。在HIV-1感染的早期，甚至整個(gè)感染過(guò)程中，通常都是R5型毒株[28-29]，隨著病程的進(jìn)展，免疫系統(tǒng)崩潰，R5型也轉(zhuǎn)變?yōu)閄4型[25,30-31]。本研究中發(fā)現(xiàn)，所有亞型和重組型的V3環(huán)序列均表現(xiàn)為R5嗜性(圖2)，表明R5型毒株在HIV-1生命周期中占有主導(dǎo)地位[24]。 如果能夠研制出抑制CCR5的藥物，將真正有效地治療艾滋病患者，所以，R5型毒株應(yīng)該被優(yōu)先用于AIDS疫苗的研究。

V1/V2、V4和V5區(qū)位于V3區(qū)的外層，是最容易受免疫攻擊的區(qū)域[19]。V1/V2、V4和V5區(qū)已經(jīng)被證明在病毒對(duì)自體中和反應(yīng)中起作用[32]。為抵抗免疫選擇，HIV-1的V1和V4區(qū)的確經(jīng)歷了多樣化的選擇壓力[33]。我們的分析也發(fā)現(xiàn)V1和V4區(qū)有高度的長(zhǎng)度多態(tài)性、異質(zhì)性和較多的糖基化位點(diǎn)，而V2和V5區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性、異質(zhì)性較低，糖基化位點(diǎn)也較少(圖1、3和4)。這4個(gè)高變區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性、異質(zhì)性和糖基化位點(diǎn)不僅促成了病毒的免疫逃逸，同時(shí)也保護(hù)V3區(qū)使其免受免疫攻擊[21]。所以，通過(guò)一些策略來(lái)降低這4個(gè)高變區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性、異質(zhì)性和糖基化位點(diǎn)數(shù)量可能是艾滋病疫苗發(fā)展的具有廣泛前景的新方向。

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