土木香和冷蒿中倍半萜內(nèi)酯化合物抑制人乳腺癌細胞增殖活性及構(gòu)－效關(guān)系研究

李 明，劉 霞，郭書翰，董 玫，杜正倫，高鵬志，宋鐵鷹* ，史清文*

1石家莊市第一醫(yī)院，石家莊050011;2 河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，河北省法醫(yī)學重點實驗室，石家莊050017

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率高，居女性惡性腫瘤的首位［1］。目前臨床上乳腺癌抗癌藥物的選擇性差，不良反應(yīng)大，使得化療藥物的使用受到一定的限制，且腫瘤轉(zhuǎn)移是引起癌癥患者死亡的主要原因。因此尋找療效確切，作用機理清楚，治愈率高，毒副作用小的抗癌藥物，攻克癌癥成為全世界醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。

土木香(Inula helenium )其根供藥用，具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效［2］。冷蒿(Artemisia frigida )全草入藥，在中藥和蒙藥上都有應(yīng)用，在中藥上主要治療黃疸型肝炎，膽囊炎，小便不利，皮膚瘙癢，濕疹，蛔蟲病和蟯蟲病，其蒙藥主治吐血，鼻出血，月經(jīng)不調(diào)，外傷出血，瘡瘍，腎熱等［3］。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)倍半萜內(nèi)酯類成分有抗腫瘤細胞增殖作用、抗炎、抗真菌和抗結(jié)核分支桿菌等作用等多樣的生物活性［4］。本文首次報道從土木香和冷蒿中純化的八種倍半萜內(nèi)酯化合物的體外抑制人乳腺癌細胞增殖活性，并探討了這八種倍半萜內(nèi)酯化合物結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 受試物

8 種倍半萜內(nèi)酯化合物:2-羥基-11，13-二氫異土木香內(nèi)酯(1)、11，13-二氫異土木香內(nèi)酯(2)、異土木香內(nèi)酯(3)、去氫-α-姜黃烯(4)、11，13-二氫愈創(chuàng)內(nèi)酯C(5)、二氫去氫木香內(nèi)酯(6)、11，13-二氫愈創(chuàng)內(nèi)酯D(7)和7α-羥基-11βH-11，13-二氫去氫木香內(nèi)酯(8)由史清文教授從菊科植物土木香和冷蒿中分離得到，均為白色針晶，經(jīng)核磁共振光譜和質(zhì)譜確定它們的結(jié)構(gòu)如圖1 所示，純度為99%。

1.2 藥品和試劑

噻唑藍(MTT，Sigma，M-2128);RPMI 1640 培養(yǎng)基(GIBCO);胰蛋白酶(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);順鉑(Sigma，034k3693)。

1.3 細胞系和培養(yǎng)條件

試驗用人乳腺癌細胞(MCF-7)和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細胞(KT)由日本千葉大學醫(yī)學部第二生物化學教室提供。各腫瘤細胞株接種于直徑為100 mm 的培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實驗方法

參照文獻［5］中的方法。將處于對數(shù)生長期的MCF-7 細胞和KT 細胞懸浮接種于96 孔板，每孔50 μL(含1 ×104個細胞)，再分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對照(終濃度0.1% DMSO)、陽性對照順鉑和終濃度為100、10 和1 μmol/L 的化合物1～8各50 μL，每組均設(shè)3 復孔，置于飽和濕度、37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/mL 四氮唑鹽(MTT)10 μL，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD 值)，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=630 nm，并計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)= (1-對照組OD值/實驗組OD 值)×100%。受試化合物對細胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill 數(shù)學模型擬合，計算受試化合物的IC50值。實驗獨立重復3 次。

圖1 八種倍半萜內(nèi)酯化合物的化學結(jié)構(gòu)ig.1 Chemical structures of eight sesquiterpene lactone compounds

1.5 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 化合物1～8 對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖2 所示，100 μmol/L 的異土木香內(nèi)酯(3)及去氫-α-姜黃烯(4)顯示與陽性對照順鉑相同的抑制腫瘤細胞增殖的活性，對MCF-7 細胞生存率分別為34.73%、25.53%、和15.91%，對KT 細胞生存率分別為21.48%、23.38%、25.53%，與空白對照組比均有顯著性差異(P ＜0.01);其他的六種倍半萜內(nèi)酯對兩種人乳腺癌細胞的增殖顯示較弱的抑制活性。

2.2 化合物3 和4 對MCF-7 細胞增殖活性的作用

化合物4 與陽性對照順鉑對MCF-7 細胞的增殖幾乎顯示相同的抑制活性，IC50分別為26. 15 μmol/L 和15.04 μmol/L，化合物3 對MCF-7 細胞的增殖抑制活性強于陽性對照順鉑，IC50僅為4.52 μmol/L?；衔? 和4 對MCF-7 細胞的增殖抑制活性呈現(xiàn)濃度梯度依賴性(圖3 和表1)。

2.3 化合物3 和4 對KT 細胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖4 和表1 所示，化合物3 和4 與陽性對照順鉑對KT 細胞的增殖幾乎顯示相同的抑制活性，化合物3 和4 對KT 細胞的IC50分別為10.10 μmol/L 和18.72 μmol/L，化合物3 和4 對KT 細胞的增殖抑制活性呈現(xiàn)濃度梯度依賴性。

圖2 倍半萜內(nèi)酯化合物對人乳腺癌細胞增殖活性的影響Fig.2 The effect of sesquiterpene lactone compounds on the proliferation of breast tumor cells

表1 異土木香內(nèi)酯和去氫-α-姜黃烯對人乳腺癌細胞增殖的影響Table 1 The effect of isoalantolactone and dehydrocostuslactone on the proliferation of breast tumor cells

3 討論

近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率呈迅速上升趨勢，成為威脅女性健康的首要殺手。由于乳腺癌的原因尚不明確，因而早期的診斷和治療是其防治的有效手段。原位乳腺癌可以通過手術(shù)切除，結(jié)合放化療等手段治愈，但是，乳腺癌易于發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移，一但乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，進入血液、淋巴、骨骼和腦等器官，增加了臨床治療的困難，也成為晚期乳腺癌難以治愈的主要原因。

植物在其漫長的進化過程中合成了許許多多結(jié)構(gòu)各異的次生代謝天然產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物具有不同的生物活性。近年來，從自然界中尋找發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗癌活性成分或先導化合物已經(jīng)成為國內(nèi)外藥物學家十分關(guān)注的課題和研究的熱點［6-8］。土木香和冷蒿均為菊科植物，含有的倍半萜內(nèi)酯化合物具有抗腫瘤、抗炎和抗真菌等多樣的生物活性［9，10］。

本研究對從土木香和冷蒿中純化的八種倍半萜內(nèi)酯化合物進行了體外抑制人乳腺癌細胞增殖活性實驗。本實驗研究結(jié)果顯示，從菊科植物土木香和冷蒿中提取純化的八種倍半萜內(nèi)酯類化合物中，異土木香內(nèi)酯和去氫-α-姜黃烯不僅對人乳腺癌細胞的增殖均有明顯的抑制作用，對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細胞的增殖均也顯示較強的抑制作用，為乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療提供了一個新的研究基礎(chǔ)。異土木香內(nèi)酯和去氫-α-姜黃烯雖然屬于不同的結(jié)構(gòu)類型，都具有，不飽和五員內(nèi)酯環(huán)，而其他的六種倍半萜內(nèi)酯化合物五元內(nèi)酯環(huán)的環(huán)外雙鍵飽和后，對乳腺癌細胞和乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細胞的增殖活性顯著降低或消失，根據(jù)實驗結(jié)果推測:倍半萜內(nèi)酯化合物抑制人腫瘤細胞增殖活性與其直型和角型結(jié)構(gòu)無關(guān)，α，β 不飽和五員內(nèi)酯是抑制腫瘤細胞增殖活性的必需基團。

隨著菊科植物中特有的倍半萜內(nèi)酯化合物對腫瘤細胞增殖抑制作用的研究的不斷深入，為倍半萜內(nèi)酯化合物的應(yīng)用開拓了新的前景，為開發(fā)具有臨床應(yīng)用價值的天然低毒的化療藥物提供實驗依據(jù)。

1 Zhou FZ(周放震)，Zhang XY(張曉云)，Sun FY(孫奮勇)，et al. Dihydromyricetin vitro antiproliferative effect on human breast cancer MDA-MB-231cells. Cancer Res Prevent Treat(腫瘤防治與研究)，2012，39:95-97.

2 Delectis Florae Republicae Popularis Sinicae Agendae Academiae Sinicae.Flora Republicae Popularis Sinicae.Beijing:Science Press，1979，75:248-254.

3 Editorial Broad of Flora Republicae Popularis Sinicae，Chinese Academy of Sciences.Flora Republicae Popularis Sinicae，1985，76(2):13-15。

4 Cantrell CL，Abate L，F(xiàn)ronczek FR，et al. Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia subtomentosa.Planta Med，1999，65:351-355.

5 Dong M，Chen SP，Kita K，et al.Anti-proliferative and apoptosis-inducible activity of Sarcodonin G from Sarcodon scabrosus in HeLa cells.Int J Oncol，2009，34:201-207.

6 Galm U，Shen B. Natural product drug discovery:the times have never been better.Chem Biol，2007，14:1098-1104.

7 Ganesan A.The impact of natural products upon modern drug discovery.Curr Opin Chem Biol，2008，12:306-317.

8 Rishton GM. Natural products as a robust source of new drugs and drug leads:past successes and present day issues.Am J Cardiol，2008，101(10A):43-49.

9 Chen JJ(陳進軍)，Wang SM(王思明)，Li CF(李存芳)，et al.Studies of sesquiterpenoids from Artemisia frigida on the anti-growth activity of human tumor cell lines. Chin J Herb Pharm，2011，22:440-443.

10 Li Y(李勇)，Li TK(李鐵庫)，Wen SW(溫世旺)，et al.In vivo and in vitro anti-tumor activity studies of five sesquiterpenoids from Inula helenium.Chin Pharm Bull(中國藥理學通報)，2010，26:112-115.