香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2在非生物脅迫下的表達(dá)分析

王安邦 金志強(qiáng) 劉菊華 賈彩紅 張建斌 苗紅霞 徐碧玉，

（1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?571101；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站 香蕉研究所，?？?571101；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

植物固著生長(zhǎng)的特性使其在生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可避免地與外界環(huán)境有著密切的關(guān)聯(lián)［1］。當(dāng)面臨逆境脅迫時(shí)，植物必須能夠應(yīng)對(duì)這些逆境才能存活［2-4］。逆境脅迫下，細(xì)胞產(chǎn)生各種異常的或受損的蛋白質(zhì)，這些異常蛋白如果在細(xì)胞內(nèi)積累過多，會(huì)影響細(xì)胞的各種代謝，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性［5］。泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是目前已知的最重要、有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑［6］，它通過調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)（turnover）或降解不正常蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種代謝過程的調(diào)節(jié)［7］。該途徑的關(guān)鍵酶主要包括泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素-蛋白連接 酶（ubiquitin-protein ligating enzyme，E3）［8］。其中E2是種類豐富的酶系，更是連接E1和E3的橋梁［9］，對(duì)泛素化修飾的特異性和精確時(shí)空性起關(guān)鍵作用［10］。

植物E2蛋白基因（LeUBC1）首次從番茄cDNA文庫中分離，并且受熱激和重金屬誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)［11］，說明E2蛋白基因在發(fā)生脅迫時(shí)可能參與細(xì)胞異常蛋白的降解過程。徐晨曦等［12］從檉柳中獲得E2基因，轉(zhuǎn)入煙草中異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因能明顯提高煙草的耐旱性。Cui等［13］發(fā)現(xiàn)擬南芥泛素結(jié)合酶UBC32定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與異常蛋白質(zhì)降解過程，可以提高擬南芥的耐鹽性。從馬鈴薯［14］和大豆中［15］也克隆到E2基因，轉(zhuǎn)入擬南芥后可提高擬南芥的抗鹽性和耐旱性。近年來，對(duì)E2基因功能研究盡管也取得了一定進(jìn)展，但相對(duì)緩慢［16］，而且關(guān)于香蕉泛素結(jié)合酶基因與植物的抗逆性關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。

香蕉喜高溫，怕低溫，生長(zhǎng)期對(duì)水分需求量大，因而溫度和水分是香蕉分布的主要限制因子。然而，由于全球異常氣候的增多，香蕉處于高溫、低溫、干旱、鹽堿、風(fēng)害等逆境的時(shí)間也增多，這嚴(yán)重影響了香蕉產(chǎn)量并制約著香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［17］，因此香蕉抗逆性研究顯得尤為重要。

李羽佳等［18］從香蕉根系均一化全長(zhǎng)cDNA 文庫中克隆了一個(gè)香蕉泛素結(jié)合酶基因，命名為MaUCE2，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因有典型的保守催化結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含有一個(gè)高度保守的半胱氨酸（cysteine）酶活性位點(diǎn)［7，16］。為了進(jìn)一步研究該基因與非生物脅迫的關(guān)系，本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）技術(shù)探究MaUCE2基因在干旱、鹽、低溫等非生物脅迫下的表達(dá)特性，旨在為研究E2基因生物學(xué)功能及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group，‘Brazilian’），采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)熱帶生物技術(shù)研究所香蕉種植園。

1.2 方法

1.2.1 香蕉MaUCE2熒光定量表達(dá)分析 采用李燕強(qiáng)等［19］改良的CTAB法提取香蕉總RNA。每個(gè)樣品取1 μL檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度后，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）合成cDNA鏈。

選用NCBI上已登錄的香蕉MaActin 片段為內(nèi)參，引物序列根據(jù)已登錄序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，MaActin 1（5'-CGAGGCTCAATCAAAGA-3'）和MaActin 2（5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3'）。MaUCE2 引物序列為MaUCE2-1（5'-CAAGACCGACAGAGCCAAGT-3'）和MaUCE2-2 （5'-CCTTAGGTGGTTTGAATGG-3'）。使用儀器為Mx3000P（Stratagene，USA），PCR反應(yīng)體系為25 μL，PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度為232 bp。熒光定量PCR 的反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性7 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次。

1.2.2 MaUCE2在不同外源脅迫下的表達(dá)特性分析

1.2.2.1 香蕉植株的干旱脅迫處理 參照張麗麗等［20］香蕉干旱處理的方法，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的香蕉組培苗，分為4組，每組3株，測(cè)定每組各盆中土壤水分含量并保持一致。第1組不做任何處理，作為對(duì)照，使土壤相對(duì)含水量保持在75%-80%；第2組低度失水干旱脅迫，使土壤相對(duì)含水量保持在55%-60%；第3組中度失水干旱脅迫，使土壤相對(duì)含水量保持在45%-50%；第4組高度失水干旱脅迫，使土壤相對(duì)含水量保持在30%-35%。每組香蕉組培苗置于人工恒溫氣候箱中培養(yǎng)，測(cè)定各盆中土壤水分含量，當(dāng)達(dá)到脅迫程度后，立即取每株組培苗根部液氮速凍，提取RNA。

1.2.2.2 香蕉植株的鹽脅迫處理 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的香蕉組培苗進(jìn)行水培養(yǎng)，在培養(yǎng)液（1/2Hoagland培養(yǎng)液）中加入200 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理。分別于0、2、4、6和8 h分別觀察和取樣，將株苗根部立即用液氮速凍，提取RNA。

1.2.2.3 香蕉植株的低溫脅迫處理 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的香蕉組培苗，分為5組，每組3株，置于人工恒溫氣候箱中培養(yǎng)。第1組溫度設(shè)為28℃，作為對(duì)照，第2組到第5組分別置于15℃、10℃、7℃、5℃溫度下2 h進(jìn)行低溫脅迫，當(dāng)達(dá)到脅迫時(shí)間后，液氮速凍，提取RNA。

2 結(jié)果

如圖1所示，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，干旱處理可以誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)，其表達(dá)量隨著干旱程度的加重而逐步上升。在高度干旱脅迫下處理下MaUCE2的表達(dá)量最高，為2.32，分別為低度干旱脅迫和中度干旱脅迫時(shí)期誘導(dǎo)的表達(dá)量的2.11倍和1.25倍。

圖1 不同程度水分脅迫下MaUCE2的表達(dá)

如圖2所示，高鹽脅迫處理下的MaUCE2的表達(dá)量隨NaCl處理時(shí)間的增加而略有升高，在脅迫6 h時(shí)最高，為1.26。處理2 h、4 h和8 h誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)量分別為1.11、1.13和0.98，與對(duì)照差異不大。

圖2 NaCl脅迫不同時(shí)間下MaUCE2的表達(dá)

如圖3所示，低溫脅迫可以誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)，其表達(dá)量隨著溫度的降低而逐步升高，當(dāng)溫度降低到5℃時(shí)，MaUCE2的表達(dá)量最高，為4.08。溫度為15℃和10℃時(shí)誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)量為1.26和1.18，與對(duì)照差異不大。

圖3 不同程度低溫脅迫下MaUCE2的表達(dá)

3 討論

逆境脅迫下，細(xì)胞產(chǎn)生各種異常的或受損的蛋白質(zhì)，這些異常蛋白如果在細(xì)胞內(nèi)積累過多，會(huì)影響細(xì)胞的各種代謝，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，而這些異常蛋白絕大部分是通過泛素-蛋白酶體途徑被降解，因此，泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵酶的大量表達(dá)與植物抗逆性的獲得有著密切的關(guān)系，而泛素結(jié)合酶E2在E1和E3之間穿梭往返運(yùn)行，具有結(jié)合并轉(zhuǎn)移泛素到靶蛋白的作用，對(duì)泛素化修飾的特異性和精確時(shí)空性起關(guān)鍵作用。

干旱脅迫是導(dǎo)致導(dǎo)致作物減產(chǎn)的最主要原因［1，21］，因此，有關(guān)植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的研究顯得極為迫切和重要。本研究結(jié)果顯示干旱脅迫后MaUCE2表達(dá)量顯著提高，說明干旱處理可以誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)。該結(jié)果與前人［12，14，15］研究結(jié)果相一致，而且本研究發(fā)現(xiàn)MaUCE2的表達(dá)量在高度干旱脅迫下表達(dá)量最高，這可能與高度干旱脅迫下細(xì)胞異常蛋白迅速增加有關(guān)。

Zhou等［15］克隆了馬鈴薯泛素結(jié)合酶基因GmUBC2，異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因能明顯提高擬南芥的耐鹽性。在鹽脅迫下該基因在擬南芥根中表達(dá)與對(duì)照差異不明顯。本研究結(jié)果顯示鹽脅迫后MaUCE2表達(dá)量略有上升，最高時(shí)是對(duì)照的1.26倍，然后基本恢復(fù)到正常水平，與對(duì)照差異也不明顯。

低溫脅迫下，MaUCE2表達(dá)量在溫度為15℃、10℃時(shí)上升不明顯，而溫度低到7℃和5℃時(shí)該基因表達(dá)量迅速上升，在5℃時(shí)表達(dá)量最大，是對(duì)照的4.08倍。這可以與植物適宜生長(zhǎng)溫度的范圍有關(guān)，有研究表明當(dāng)溫度小于8℃時(shí)香蕉苗開始受到寒害［22］，因此當(dāng)溫度低于8℃后細(xì)胞產(chǎn)生各種異常的或受損的蛋白質(zhì)增多，導(dǎo)致MaUCE2表達(dá)量迅速增高。

目前大多數(shù)植物的泛素結(jié)合酶蛋白功能的研究還處于起步階段，因此從不同植物中克隆及研究泛素結(jié)合酶功能顯得尤為重要。本研究初步驗(yàn)證了香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2在植物抗逆過程中可能起著重要作用，但MaUCE2在植物抗逆過程中具體的功能和機(jī)制尚需深入研究。

4 結(jié)論

在鹽、低溫和干旱脅迫下，香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2表達(dá)量發(fā)生明顯變化，表明香蕉中的泛素結(jié)合酶基因具有響應(yīng)非生物脅迫能力，可能在香蕉適應(yīng)逆境中發(fā)揮重要作用。

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