利用轉(zhuǎn)基因途徑提高植物非生物脅迫耐受性的研究進(jìn)展

劉春 曹麗敏 李玉中 彭晚霞 麻浩

（1.衡陽(yáng)師范學(xué)院，衡陽(yáng) 421008；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)沙 410125；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

非生物脅迫貽誤植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)率并且引發(fā)一系列形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子方面的變化。干旱、極端溫度和鹽堿化土壤是植物遇到的最常見(jiàn)的非生物脅迫。全球約有22%的農(nóng)業(yè)土壤鹽堿化［1］，干旱土壤面積已經(jīng)擴(kuò)大并且未來(lái)將進(jìn)一步擴(kuò)大。常見(jiàn)作物暴露在多種脅迫下，其感受和響應(yīng)不同環(huán)境因子的方式可能是重疊的。干旱或鹽分脅迫下大麥植株的基因表達(dá)譜表明，雖然在響應(yīng)不同脅迫方面各種基因是差異化調(diào)控的，但它們可能誘導(dǎo)一種類似的防御反應(yīng)［2］。

當(dāng)植物遭遇非生物脅迫時(shí)，一系列基因被誘導(dǎo)，導(dǎo)致一些代謝物和蛋白質(zhì)含量水平的增加，其中一些可能響應(yīng)這些非生物脅迫從而起到某種程度的保護(hù)作用。與脅迫耐受性相關(guān)的常規(guī)育種常常從供體親本帶來(lái)不理想的農(nóng)藝性狀。因此，通過(guò)導(dǎo)入和/或過(guò)表達(dá)被選基因的基因工程植物的發(fā)展可能是促進(jìn)改良植物育種的可行選擇。同時(shí)，當(dāng)有益基因源自有雜交障礙的物種、遠(yuǎn)親或非植物生物時(shí)基因工程將是唯一的選擇。實(shí)際上，已在轉(zhuǎn)基因植株中測(cè)試了多種與抗性相關(guān)的性狀，而且各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)已被用來(lái)提高植物的脅迫耐受性［3］。

如何評(píng)估轉(zhuǎn)基因植株的安全性，以及如何將模式植物中的基因效應(yīng)應(yīng)用到作物品種中去是很重要的。但目前涉及非生物脅迫轉(zhuǎn)基因植物評(píng)估的大量文獻(xiàn)表明，試驗(yàn)室條件下的轉(zhuǎn)基因效應(yīng)不太可能在自然條件下發(fā)生。因此，這里需要一套對(duì)轉(zhuǎn)基因植株響應(yīng)大田環(huán)境下非生物脅迫進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)槠褚淹度氲墓ぷ鞔蟛糠謨H集中在少數(shù)模式植物上。

本文總結(jié)了在干旱、鹽分和低溫脅迫方面利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)非生物脅迫耐受性的研究進(jìn)展，以及如何對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行評(píng)估。

1 單結(jié)構(gòu)基因

1.1 滲透保護(hù)劑基因

嚴(yán)重的滲透脅迫是細(xì)胞成分有害變化的原因。迄今已在脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植株中應(yīng)用了在滲透調(diào)節(jié)期間積累的與滲透保護(hù)劑合成有關(guān)的許多基因［4］。在耐逆境生物中特殊滲透保護(hù)劑是自然積累的，但許多作物缺少合成特殊滲透保護(hù)劑的能力。如果在干旱、鹽分和高溫響應(yīng)中滲透調(diào)節(jié)基因可以引發(fā)，那么滲透調(diào)節(jié)是植物非生物脅迫耐受性的一個(gè)好策略。因此，已經(jīng)用來(lái)設(shè)計(jì)某些滲透因子或通過(guò)在植物中過(guò)表達(dá)這些滲透因子，作為耐逆境作物育種的一個(gè)潛在路線。該路線的第一步已通過(guò)編碼滲透因子合成酶的基因工程獲得耐逆轉(zhuǎn)基因植株［5］。已有如甘氨酸-甜菜堿［6］和脯氨酸［7］等滲透保護(hù)劑應(yīng)用的報(bào)道。同樣，一些糖醇已作為過(guò)量產(chǎn)生相容性溶質(zhì)的基因工程的目標(biāo)，從而在脅迫期間保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)復(fù)合物［8］。類似的，過(guò)量表達(dá)多胺的基因工程也已發(fā)展［9］。鑒定、分離、克隆與提高洪水脅迫耐受性的相關(guān)基因的研究集中于糖酵解和乙醇發(fā)酵途徑的酶類，該途徑揭示在缺氧脅迫響應(yīng)中呼吸鏈?zhǔn)鞘苡绊懙闹饕緩?。?duì)煙草和水稻中丙酮酸脫羧酶（pdc）和乙醇脫氫酶（adh）基因水平的改變進(jìn)行了研究，以便闡明其在水淹耐受性中的作用。過(guò)表達(dá)和低表達(dá)pdc1基因的轉(zhuǎn)基因水稻也得到發(fā)展，并顯示出在水淹后的生存率與高PDC的活性正相關(guān)［10］。

在上述的大部分例子中，生物合成和代謝途徑的轉(zhuǎn)基因修飾結(jié)果揭示了脅迫耐受性的提高和相容性溶質(zhì)的積累也可能通過(guò)清除活性氧（ROS）以及在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中通過(guò)其活化類分子伴侶來(lái)實(shí)現(xiàn)［11］。然而，觀察到初級(jí)代謝的內(nèi)生途徑紊亂導(dǎo)致的多種有害效應(yīng)，如細(xì)胞壞死和生長(zhǎng)遲緩。同樣，在滲透脅迫對(duì)產(chǎn)量潛能的負(fù)效應(yīng)方面也有一些報(bào)道［12］。相容性溶質(zhì)的基因操作并非總是導(dǎo)致化合物的顯著積累，表明相容性溶質(zhì)的功能不限于滲透調(diào)節(jié)，而且滲透保護(hù)劑可能并非總能提高干旱耐受性。利用鷹嘴豆的一項(xiàng)研究顯示在干旱脅迫下滲透調(diào)節(jié)不能對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生有益的影響［13］。

1.2 解毒基因

在大多數(shù)好氧生物中，需要有效消除由環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的ROS。根據(jù)ROS的性質(zhì)，一些高毒性的需要立即解毒。為了控制ROS的水平和保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害，植物已進(jìn)化出一套復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)以清除ROS?？寡趸到y(tǒng)包括可能在植物ROS信號(hào)中起了重要作用的各種酶類和非酶類代謝物［14］。通過(guò)解毒策略獲得增強(qiáng)了非生物脅迫耐受性的一些轉(zhuǎn)基因植物，包括過(guò)表達(dá)諸如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）、過(guò)氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等與氧化保護(hù)有關(guān)的酶類的轉(zhuǎn)基因植物［15］。過(guò)表達(dá)葉綠體Cu/Zn SOD的轉(zhuǎn)基因煙草［16］和馬鈴薯植株［17］在低溫脅迫下光合性能急劇改善。過(guò)表達(dá)Mn SOD的轉(zhuǎn)基因煙草植株只有在其他抗氧化酶類和底物存在時(shí)才能增強(qiáng)其對(duì)氧化脅迫的耐受性，表明基因型和同工酶的組成對(duì)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫耐受性也有深刻的影響［18］。在葉綠體中過(guò)表達(dá)Mn SOD的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿（Medicago sativa）植株顯示能降低膜損傷［19］，轉(zhuǎn)基因煙草植株過(guò)量產(chǎn)生紫花苜蓿醛糖還原酶基因（MsALR）顯示能降低活性醛類的濃度和增強(qiáng)對(duì)氧化劑和干旱脅迫的耐受性［20］。

1.3 胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白

胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白（LEA）代表另一類高分子量蛋白質(zhì)，該類蛋白質(zhì)在胚胎發(fā)生晚期豐富，并在種子脫水期和對(duì)水分脅迫的響應(yīng)中積累。在幾組LEA蛋白中，屬于第3組的被預(yù)測(cè)在隔離離子方面起作用，該組蛋白質(zhì)具有11個(gè)串聯(lián)重復(fù)的氨基酸模序，該模序具有重復(fù)多達(dá)13次的保守序列TAQAAKEKAGE［21］。第1組LEA蛋白被推測(cè)具有增強(qiáng)水分結(jié)合的能力，第5組LEA蛋白被認(rèn)為在水分喪失時(shí)隔離離子。組成型過(guò)表達(dá)來(lái)自大麥的一個(gè)第3組LEA蛋白質(zhì)HVA1賦予轉(zhuǎn)基因水稻植株脫水和鹽分脅迫耐受性［22］。盡管與先前報(bào)道的小麥栽培種、轉(zhuǎn)基因水稻（TNG67）植株表達(dá)小麥LEA2蛋白（PMA80）基因或小麥LEA1蛋白（PMA1959）基因?qū)е旅撍望}分脅迫耐受性增加的數(shù)據(jù)相比，上述報(bào)道的水分利用率（WUE）極低［23］，但在鹽分和水分脅迫條件下小麥和水稻的細(xì)胞完整性方面，組成型或脅迫誘導(dǎo)表達(dá)HVA1基因?qū)е旅{迫耐受性的增強(qiáng)和生長(zhǎng)特征的改善［24］。

1.4 轉(zhuǎn)運(yùn)體基因

取得非生物脅迫高耐受性的一個(gè)重要策略是幫助植物在脅迫條件下恢復(fù)離子和滲透的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這是利用基因工程提高植物鹽分耐受性的一個(gè)主要途徑，該途徑的目標(biāo)是將Na+排出根部，或貯存在液泡里。通過(guò)加強(qiáng)控制轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白產(chǎn)生了許多非生物脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物。例如，在鹽分脅迫條件下表達(dá)HAL1基因的轉(zhuǎn)基因甜瓜［25］和番茄［26］植株，因其比對(duì)照植株保留更多的K+而表現(xiàn)出一定水平的鹽分耐受性。

與陽(yáng)離子脫毒有關(guān)的液泡氯通道基因 AtCLCd 和與酵母 NhxI 基因同源的 AtNHXI 基因已被克隆，過(guò)表達(dá)這些基因的擬南芥植株通過(guò)Na+在液泡中的區(qū)室化而增強(qiáng)其鹽分耐受性。過(guò)表達(dá)AtNHX1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥和番茄植株通過(guò)在液泡膜中積累充足數(shù)量的轉(zhuǎn)運(yùn)體而表現(xiàn)出持續(xù)增強(qiáng)的鹽分耐受性［27］。擬南芥中的SOS1與來(lái)自細(xì)菌和真菌質(zhì)膜中的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)體具有相似性，已被克隆并利用CaMV 35S啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)。上調(diào)SOS1基因能提供更大的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)，該動(dòng)力勢(shì)對(duì)于提高Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)體活性是必需的［28］。

1.5 脂類生物合成基因

對(duì)于轉(zhuǎn)基因途徑，人們也計(jì)劃通過(guò)改變膜的脂類生化性質(zhì)來(lái)增強(qiáng)非生物脅迫條件下的光合作用?；罴?xì)胞對(duì)低溫的適應(yīng)性是通過(guò)增加脂肪酸的不飽和性導(dǎo)致膜脂組成改變而實(shí)現(xiàn)。過(guò)表達(dá)來(lái)自西葫蘆（Cucurbita maxima）和擬南芥［29］的葉綠體丙三醇-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）基因（涉及磷脂酰丙三醇脂肪酸去飽和）的基因工程煙草植株，因增加了一些不飽和脂肪酸而相應(yīng)地降低了對(duì)其低溫的敏感性。此外，沉默表達(dá)葉綠體ω3-脂肪酸去飽和酶（Fad7，合成三烯脂肪酸）的轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型相比能適應(yīng)高溫［30］。

1.6 熱激蛋白基因

熱休克反應(yīng)能增加響應(yīng)熱或其他毒劑的一套基因的轉(zhuǎn)錄，是一個(gè)高度保守的生物學(xué)反應(yīng)，發(fā)生在所有生物體中［31］。該反應(yīng)受熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）的介導(dǎo)，該轉(zhuǎn)錄因子在無(wú)脅迫細(xì)胞中以單體的、非DNA結(jié)合的形式存在，在脅迫下被激活成能結(jié)合熱激基因啟動(dòng)子的三聚體形式。熱激蛋白（Hsps）編碼基因的誘導(dǎo)是生物體暴露在高溫下時(shí)，在分子水平被觀察到的一個(gè)非常突出的反應(yīng)［32］。

在植物中通過(guò)增加熱激蛋白的合成提高耐熱性的基因工程已成功獲得許多轉(zhuǎn)基因植物［33］。盡管利用這些熱激蛋白賦予植物脅迫耐受性的精確機(jī)理未知，但最近的研究證明，在體內(nèi)能被組裝成功能性脅迫顆粒（HSGs）而獲得熱保護(hù)功能［34］。

2 調(diào)控基因

為了修復(fù)細(xì)胞功能使植物對(duì)脅迫更有耐性，轉(zhuǎn)移編碼單個(gè)特異脅迫蛋白的基因可能是不夠的。為了克服這些不足，利用一個(gè)基因編碼一個(gè)調(diào)節(jié)許多其他基因的脅迫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，從而增強(qiáng)面向多種脅迫的耐受性是一個(gè)有希望的途徑［35］。因此，最近作物基因工程偏愛(ài)的第二類基因是那些開(kāi)啟調(diào)節(jié)與非生物脅迫相關(guān)的多個(gè)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因。

2.1 轉(zhuǎn)錄因子

分子生物學(xué)研究表明，植物中由諸如干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫因子誘導(dǎo)的幾個(gè)基因具有多種功能。大多數(shù)干旱應(yīng)答基因是由植物激素脫落酸（ABA）誘導(dǎo)的，但也有少數(shù)基因例外。對(duì)模式植物擬南芥基因表達(dá)中的干旱應(yīng)答基因的分析表明，至少存在4個(gè)獨(dú)立調(diào)節(jié)系統(tǒng)。對(duì)典型脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的一些基因中啟動(dòng)子的順勢(shì)作用元件和影響這些基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子也進(jìn)行了分析。分離出與脫水響應(yīng)元件/C重復(fù)序列（DRE /CRT）順勢(shì)作用元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并命名為DRE 結(jié)合蛋白1/C重復(fù)序列結(jié)合因子（DREB1/ CBF）和DRE結(jié)合蛋白2（DREB2）。在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，DREB1/CBF 過(guò)量表達(dá)可增加其抗寒、抗旱和抗鹽堿的能力。DREB1/CBF 基因成功地在許多不同作物中得到應(yīng)用，從而提高作物對(duì)非生物脅迫的耐受性。對(duì)與脅迫反應(yīng)相關(guān)的其他轉(zhuǎn)錄因子的研究也取得了進(jìn)展。有關(guān)這方面的內(nèi)容，已有不少綜述［36-38］。

2.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因

植物為適應(yīng)各種外界環(huán)境刺激，以最大限度地減少逆境對(duì)自身的傷害，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，從對(duì)逆境信號(hào)的感知、胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞，到最終表達(dá)各種逆境基因，產(chǎn)生適應(yīng)性，形成了一系列復(fù)雜的逆境信號(hào)傳遞的分子機(jī)制。雖然在細(xì)胞水平的基因調(diào)節(jié)存在多途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，但同一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分可能被干旱、鹽分和寒冷等各種脅迫因子分享［39］。ABA是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用的已知成分之一，ABA信號(hào)途徑的主要負(fù)調(diào)控因子——蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶（PSP），為ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的關(guān)鍵組分。擬南芥中PP2C主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它們通過(guò)改變ABA信號(hào)的強(qiáng)弱等調(diào)控植物的脅迫應(yīng)答［40］。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)途徑信號(hào)通路在真核生物細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)換和放大過(guò)程中起重要作用。MAPK 級(jí)聯(lián)途徑由3個(gè)成員組成，分別是MAPK、MAPKK 及MAPKKK，這3個(gè)信號(hào)組分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK 的方式依次磷酸化將外源信號(hào)級(jí)聯(lián)放大向下傳遞。大量研究表明，植物MAPK 級(jí)聯(lián)途徑參與調(diào)控脫落酸（ABA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［41］。Ca2+作為植物細(xì)胞中最重要的第二信使，參與植物對(duì)許多逆境信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在非生物逆境條件下，植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+在時(shí)間、空間及濃度上會(huì)出現(xiàn)特異性變化，即誘發(fā)產(chǎn)生鈣信號(hào)。鈣信號(hào)再通過(guò)其下游的鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)引起一系列的生物化學(xué)反應(yīng)以適應(yīng)或抵制各種逆境脅迫。目前，在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Ca2+/CDPK、Ca2+/ CaM和Ca2+/CBL 3類鈣信號(hào)系統(tǒng)，研究表明它們與非生物逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)［42］。

操縱信號(hào)因子的優(yōu)點(diǎn)之一是它們可以控制許多的下游事件，這些事件可導(dǎo)致在多方面超級(jí)耐性。改變這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分是降低細(xì)胞對(duì)脅迫環(huán)境敏感的途徑。在擬南芥植株中過(guò)表達(dá)功能性保守的At-DBF2（酵母DBf2激酶同系物）表現(xiàn)出顯著的多脅迫耐受性［43］。Pardo等［44］通過(guò)過(guò)表達(dá)鈣調(diào)磷酸酶也獲得了鹽分脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植株。在擬南芥中過(guò)表達(dá)一個(gè)滲透脅迫活化蛋白激酶——SRK2C，導(dǎo)致較高的干旱耐受性，這與脅迫響應(yīng)基因的上調(diào)相一致。類似的，煙草MAPKKK、NPK1在玉米中激活了一個(gè)氧化信號(hào)級(jí)聯(lián)使轉(zhuǎn)基因植株具寒冷、熱、鹽分和干旱耐受性［45］。然而，信號(hào)因子的抑制也可有效增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受性［46］。這個(gè)假設(shè)是基于先前的報(bào)道揭示的法昵基轉(zhuǎn)移酶ERA1的a亞基和b亞基行使ABA信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)子的功能［47］。條件反義下調(diào)法昵基轉(zhuǎn)移酶a和b亞基導(dǎo)致增強(qiáng)了擬南芥和canola油菜植株的干旱耐受性。

3 啟動(dòng)子的選擇

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)重要方面是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)決定選擇啟動(dòng)子以便增加基因的表達(dá)水平時(shí)，轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)也是一個(gè)重要的考量。因此，啟動(dòng)子的類型和啟動(dòng)子的強(qiáng)度對(duì)于調(diào)整植物對(duì)脅迫的響應(yīng)是很關(guān)鍵的。一些基因的產(chǎn)物是大量的，如LEA3，從而需要一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子。而有些基因產(chǎn)物，如多胺生物合成需要的酶，最好使用一個(gè)中等強(qiáng)度的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。迄今在產(chǎn)生非生物脅迫耐受性植物方面最常用的啟動(dòng)子包括CaMV 35S、泛素1和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子在自然界是組成型的，通過(guò)它們使轉(zhuǎn)入的基因及其下游在所有器官和階段大量表達(dá)。但諸如海藻糖［48］或多胺［49］等分子的組成型過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致在正常生長(zhǎng)條件下植株的異常。且上述分子的產(chǎn)生也是昂貴的代謝。在這種情況下，利用脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子更合適。在植物中，各種非生物脅迫誘導(dǎo)許多被很好描述的有用啟動(dòng)子。一個(gè)理想的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不僅應(yīng)該在缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)無(wú)任何本底水平的基因表達(dá)，而且表達(dá)應(yīng)是劑量依賴性的和可逆的。為了鑒定出與被非生物脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)有關(guān)的幾種順式作用和反式作用元件，分析了干旱誘導(dǎo)和寒冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域［50］。大部分脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含一個(gè)脅迫特異性順式作用元件，該元件被必需轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別。例如，hsp基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是受定位于這些基因啟動(dòng)子區(qū)域5’ TATA box的核心熱激元件（HSE）介導(dǎo)的。目前所有植物的hsp基因序列顯示，在TATA基序鄰近區(qū)域含有多個(gè)部分重疊的HSEs。除了這些hsp啟動(dòng)子，也有人在研究受滲透脅迫和缺氧脅迫誘導(dǎo)的rd29和adh基因啟動(dòng)子。擬南芥rd29A和rd29B是脅迫響應(yīng)基因，脫水、高鹽和低溫誘導(dǎo)基因的rd29A啟動(dòng)子包括DRE 和ABRE兩個(gè)元件，而rd29B啟動(dòng)子只包括ABREs，并且是依賴ABA誘導(dǎo)的。過(guò)表達(dá)來(lái)自rd29A脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的DREB1A轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植株，比利用獲得組成型CaMV 35S啟動(dòng)子的植株表現(xiàn)出更好的表型生長(zhǎng)［51］。Lee［52］利用來(lái)自大麥HAV22的ABRC1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄中獲得一個(gè)脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的擬南芥CBF1。基因表達(dá)是受DREB1A誘導(dǎo)的，DREB1A是受寒冷和水分脅迫誘導(dǎo)的，在rd29A、rd17、cor6.6、cor15A、erd10等基因的啟動(dòng)子中的一個(gè)順式作用DRE元件，因此，基因產(chǎn)物的合成賦予植物低溫和水分脅迫耐受性。玉米和水稻中呼吸鏈adh1基因啟動(dòng)子區(qū)域包含一個(gè)缺氧響應(yīng)元件（ARE），缺氧響應(yīng)元件（ARE）具有TGGTTT的核心元件保守序列。此外，已在如Cor 6.6、Cor 15 和 Cor 78基因中鑒定出其他的脅迫響應(yīng)順式作用啟動(dòng)子序列，如具有A/GCCGAC保守序列的低溫響應(yīng)元件（LTRD）。在脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子方面的這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致基因工程化脅迫耐受性作物范式的重要轉(zhuǎn)變［53］。

4 脅迫效應(yīng)的生理評(píng)價(jià)

許多研究在不同的植物中評(píng)估了響應(yīng)，諸如干旱、鹽分和寒冷等不同脅迫的轉(zhuǎn)基因效應(yīng)。但用于評(píng)估脅迫響應(yīng)的方法卻鮮有詳細(xì)信息。因此，在接下來(lái)的討論中，我們將專注于農(nóng)藝/生理視角的評(píng)估，但不意味著挑戰(zhàn)在基因表達(dá)評(píng)估方面所做的大量工作。我們的目的是嘗試協(xié)調(diào)分子和農(nóng)藝兩種途徑朝向一個(gè)方向：育種。在轉(zhuǎn)基因的脅迫響應(yīng)評(píng)估方面有兩個(gè)主要的議題需要強(qiáng)調(diào)：（1）強(qiáng)加的脅迫方式，有關(guān)脅迫的詳細(xì)信息和生長(zhǎng)條件；（2）支持結(jié)論的測(cè)試材料在響應(yīng)方面的數(shù)據(jù)。

4.1 脅迫方式、生長(zhǎng)環(huán)境和評(píng)價(jià)

迄今，在大部分報(bào)道中用于評(píng)估轉(zhuǎn)基因材料的脅迫條件常常太嚴(yán)峻［54］。例如，Pellegrineschi 等［55］通過(guò)持續(xù)10 d不給盆栽的兩周齡小麥苗澆水，而后復(fù)水直至成熟，比較了轉(zhuǎn)DREB1A基因小麥與野生親本的表現(xiàn)。未轉(zhuǎn)化的植株在強(qiáng)加脅迫10-15 d內(nèi)幾乎全部死亡，但轉(zhuǎn)基因植株存活下來(lái)，這樣的脅迫條件在大田環(huán)境下可能不會(huì)發(fā)生。Pilon-Smits等［56］報(bào)道在水培中利用聚乙二醇（PEG）可以有效的測(cè)試植物在給定的滲透勢(shì)下的某些反應(yīng)，與在土壤中的環(huán)境相比，水培提供了相對(duì)不同的條件，水培溶液成分是有限且明確的。在這里，觀察到的生長(zhǎng)改良被解釋為轉(zhuǎn)基因植株的滲透劑的產(chǎn)生。因?yàn)樵谒鄺l件下水容量是無(wú)限的且水勢(shì)恒定，在該系統(tǒng)中這種情況有發(fā)生的可能。然而，在土壤環(huán)境中，根周圍土壤中供利用的水分體積是有限的，當(dāng)水分被根攝取后土壤中水勢(shì)會(huì)迅速下降，甚至轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)滲透劑產(chǎn)物可能不能攝取更多的水分。利用滲透勢(shì)增強(qiáng)型轉(zhuǎn)基因的一個(gè)更現(xiàn)實(shí)的水分?jǐn)z取能力測(cè)試是比較它們從土壤系統(tǒng)中攝取水分的能力。Sivamani等［57］報(bào)道了在轉(zhuǎn)基因小麥中WUE的增加，不幸的是報(bào)道中沒(méi)有土壤蒸發(fā)的對(duì)照，而土壤蒸發(fā)是大部分水分喪失和觀察到非常低的WUE的原因。此外，利用鮮重和生長(zhǎng)率、莖的生長(zhǎng)［52］或存活下來(lái)［44］等其他表現(xiàn)來(lái)間接評(píng)估很可能得出不一致的結(jié)果。因此，當(dāng)實(shí)施干旱脅迫時(shí)，應(yīng)對(duì)有關(guān)生長(zhǎng)環(huán)境、植株大小、容器型號(hào)、水分供給和蒸騰作用等做詳盡的描述。

4.2 應(yīng)用于干旱和鹽分脅迫的多種方案

在做轉(zhuǎn)基因評(píng)估時(shí)，干旱脅迫的實(shí)施不是簡(jiǎn)單的截留水分。實(shí)際上，如果不了解植物在自然環(huán)境中對(duì)干旱響應(yīng)的不同階段，我們就不能洞察植物的干旱響應(yīng)機(jī)理。這些階段已在早先進(jìn)行了描述［58，59］（圖1）。在階段I，水分豐富，植物可通過(guò)氣孔全開(kāi)放的蒸騰作用攝取全部所需水分。在此階段，水分喪失主要決定于葉子所處的環(huán)境條件。階段II期間，根不再能夠給莖提供充足的水分，氣孔逐漸關(guān)閉以調(diào)節(jié)水分供給和喪失之間的平衡，從而維持葉片的膨壓。在階段III，根已經(jīng)耗盡所有可供蒸騰作用的水分。氣孔關(guān)閉、包括光合作用在內(nèi)的幾乎所有有助于生長(zhǎng)的生理過(guò)程均被抑制。該過(guò)程常用于設(shè)計(jì)脫水試驗(yàn)，在試驗(yàn)中植物對(duì)干旱的響應(yīng)是根據(jù)可供給植物的土壤水分部分（可蒸發(fā)的土壤水分部分，F(xiàn)TSW），而不是實(shí)施脅迫后的天數(shù)。這樣，允許在強(qiáng)加脅迫的試驗(yàn)和自然環(huán)境條件之間有一個(gè)精確的比較，這一方法在國(guó)際半干旱地區(qū)熱帶作物研究所（ICRISAT）成功用于評(píng)估溫室環(huán)境下14個(gè)轉(zhuǎn)受rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DREB1A基因花生（圖1）的響應(yīng)情況［59］。

圖1 花生品種JL 24對(duì)土壤干旱脅迫的一個(gè)典型響應(yīng)曲線［59］

關(guān)于鹽分脅迫，迄今大部分評(píng)估報(bào)道主要在苗期進(jìn)行，但鹽脅迫下植物在后期表現(xiàn)如何更值得探究。此外，評(píng)估是通過(guò)利用高濃度的鹽分在短期內(nèi)做出的，但這些發(fā)現(xiàn)甚至在高鹽自然環(huán)境中顯然放大了轉(zhuǎn)基因工程的耐鹽效應(yīng)。因此，用過(guò)高濃度的鹽分進(jìn)行評(píng)估的方法應(yīng)該避免。

我們常常假設(shè)避免Na+的積累和毒性可賦予植物鹽分耐受性。因此，大部分轉(zhuǎn)基因工作是處理涉及從根部排出Na+或?qū)a+區(qū)室化于液泡中的基因。雖然在水培條件下的嚴(yán)峻脅迫（超過(guò)200-300 mmol/L）［6，52］在自然環(huán)境中是不太可能發(fā)生的，但該試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因植株能排泄Na+，并能維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，Vadez等［60］報(bào)道在鷹嘴豆中鹽分耐受性與Na+的積累差異無(wú)關(guān)。因此，在鷹嘴豆中Na+的排出策略有待進(jìn)一步研究。

此外，也可根據(jù)種子產(chǎn)量對(duì)植物脅迫耐受性進(jìn)行評(píng)估，因?yàn)樯成L(zhǎng)可能是受鹽分影響的關(guān)鍵生理階段。因此，有意增強(qiáng)鹽分耐受性的轉(zhuǎn)基因研究應(yīng)該集中于對(duì)脅迫敏感的階段。對(duì)這些過(guò)程的全面研究將有助于設(shè)計(jì)出一條更合適的轉(zhuǎn)基因途徑。

5 結(jié)論

本文總結(jié)了通過(guò)利用一些已克隆和描述的脅迫相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子來(lái)提高植物非生物脅迫耐受性的研究進(jìn)展。發(fā)展非生物脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物的最初嘗試始于單結(jié)構(gòu)基因，脅迫誘導(dǎo)的已知功能蛋白質(zhì)如水分通道蛋白、參與滲透物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶、脫毒酶類，以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物轉(zhuǎn)化的最初目標(biāo)。實(shí)際上，代謝性狀，尤其是少數(shù)酶類作用途徑的遺傳特征已被闡明，并且似乎比結(jié)構(gòu)和發(fā)育性狀更易操縱。然而，該途徑被忽視的一個(gè)事實(shí)是非生物脅迫耐受性同時(shí)與許多基因有關(guān)，單個(gè)基因的耐受性是不太可能持續(xù)發(fā)展的。因此，第二階段的轉(zhuǎn)化試圖利用第三類脅迫誘導(dǎo)基因即調(diào)節(jié)蛋白來(lái)轉(zhuǎn)化植物。通過(guò)這些蛋白質(zhì)，許多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因可被單個(gè)基因編碼的脅迫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)調(diào)節(jié)［51］，從而增強(qiáng)對(duì)干旱、鹽分和冰凍在內(nèi)的多種脅迫的耐受性。

基因工程允許對(duì)基因進(jìn)行時(shí)間、組織特異性操作，以及發(fā)揮導(dǎo)入基因最適功能的表達(dá)水平。在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株中最廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型表達(dá)，然而，當(dāng)基因表達(dá)需要設(shè)計(jì)成在特異器官或特異時(shí)間表達(dá)時(shí)，這種組成型啟動(dòng)子可能并非合適的選擇，尤其是對(duì)于脅迫誘導(dǎo)的基因來(lái)說(shuō)。因此，最近更致力于利用脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。

最后，如何對(duì)特定的非生物脅迫耐受性進(jìn)行評(píng)估，尤其是自然環(huán)境條件下的非生物脅迫耐受性的評(píng)估，以及在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得的耐受性是否在自然條件下優(yōu)于現(xiàn)有植物本身的耐受性，都是有待進(jìn)一步解決的問(wèn)題，響應(yīng)非生物脅迫的不同代謝物產(chǎn)出的生物成本及其對(duì)產(chǎn)量的影響亦需進(jìn)行正確的評(píng)估。

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