利用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)人胰高血糖素樣肽1的研究

梁宏偉 陳發(fā)菊 王玉兵 李鳳蘭 陸海

（1.三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443002； 2. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

II型糖尿病是一種以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和作用缺陷所引起，是影響人類健康的一種主要疾病之一。目前，對II型糖尿病患者的治療主要從飲食、運(yùn)動以及使用藥物等幾個方面著手，新的治療手段主要是控制機(jī)體代謝、增加胰島β-細(xì)胞數(shù)量和維持其正常生理功能［1］。人胰高血糖素樣肽1（hGLP1）是一種腸肽激素，主要由末端空腸、回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞所分泌，是胰高血糖素原（proglucagon）基因翻譯后加工和修飾的產(chǎn)物，主要通過與G蛋白偶聯(lián)的受體結(jié)合后發(fā)揮其生理功能［2］。hGLP1作為一種腸降血糖素，能夠誘導(dǎo)胰島β-細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)葡萄糖依賴的胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，減緩胃腸蠕動和饑餓感，減少飲食，從而達(dá)到降低血糖的水平［3］。hGLP1能夠明顯降低Ⅱ型糖尿病患者空腹和餐后血糖水平，對Ⅱ型糖尿病具有較好的療效，同時對Ⅰ型糖尿病的治療也具有一定的潛力［4］。

煙草是轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組藥用蛋白、抗體、基因工程疫苗研究的模式植物，其遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟完善。目前利用轉(zhuǎn)基因煙草已成功表達(dá)了葡萄腦苷脂酶（β-glucocerebrosidase）［5］、人生長激素（hGH）［6］，以及針對霍亂病毒（cholera）［7］、人類乳突病毒（HPV）［8］、艾滋?。℉IV）［9］和炭疽桿菌（anthrax）［10］等多種治療性蛋白或疫苗。本研究利用煙草這一成熟轉(zhuǎn)化體系，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將人胰高血糖素樣肽1（hGLP1）基因?qū)霟煵葜?，并通過動物試驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步的生物活性檢測，旨在為轉(zhuǎn)基因煙草作生物反應(yīng)器表達(dá)人胰高血糖素樣肽1提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草（Nicotiana tabacum L.），本實(shí)驗(yàn)室保存。昆明小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，雄性，6-7周齡，體重18-22 g，SPF級，質(zhì)量合格證號：SCXK-（軍）-2007-004。

各種限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司；所有引物均由上海生工公司合成；Southern blot試劑盒購自Roche（Germany）公司；Marker DNA、2×Taq MasterMix、Western blot試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；各種激素、抗生素和組培生化試劑購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

hGLP1基因和PBI121表達(dá)載體由三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心惠贈，將含有His-tag標(biāo)簽的hGLP1基因克隆至PBI121質(zhì)粒CaMV35S啟動子下游，hGLP1基因兩端限制性酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和SmaⅠ，T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意見，圖1。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 植物表達(dá)載體PBI121質(zhì)粒（包含hGLP1基因）T-DNA區(qū)

葉片不定芽分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉5.2 g/L；繼代、生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉5.4 g/L； 遺傳轉(zhuǎn)化的選擇壓力為30 mg/L卡那霉素（Km），除菌羧芐青霉素（Carb）為500 mg/L。以上培養(yǎng)基配制時均調(diào)pH值6.0。

1.2 方法

1.2.1 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 采用葉盤法［11］進(jìn)行農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化。用含有PBI121-GLP1表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101侵染過夜預(yù)培養(yǎng)的煙草小葉塊（0.5 cm×0.5 cm）5 min，然后吸去附著的菌液置于（25±2）℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入附加30 mg/L卡那霉素和500 mg/L羧芐青霉素的不定芽分化培養(yǎng)基上，（25±2）℃，16/8 h光周期下進(jìn)行選擇培養(yǎng)，3周后葉片外植體開始分化出抗性不定芽，待不定芽長到1 cm以上時，切下并接入附加30 mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.2 GUS組織化學(xué)染色 GUS染色液配方參照J(rèn)efferson等［12］方法稍作修改。50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0）中含有5 mmol/L K4Fe［CN］6，5 mmol/L K3Fe［CN］6，10 mmol/L EDTA-Na2，0.1%（V/V）Triton X-100，20%甲醇，1 mg/L的X-Gluc。X-Gluc需提前溶于DMSO中，再加入上述緩沖液里，混勻后分裝于2.0 mL離心管中置-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)檢測

1.2.3.1 PCR檢測 采用CTAB法［13］提取轉(zhuǎn)化植株和野生型煙草植株總DNA。以PBI121-GLP1質(zhì)粒DNA為陽性對照，野生型煙草總DNA為陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增檢測引物：GLP1-F：5'-GGATCCACCATGGGGCATCATCATC-3'；GLP1-R：5'-GCACCAGTCTTCCCTTAACCAGCCAAG-3'。擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火35 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃ 延伸10 min。

1.2.3.2 Southern blot檢測 通過PCR擴(kuò)增PBI121-GLP1質(zhì)粒DNA，回收GLP1基因片段，按照Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter kit Ⅱ操作手冊標(biāo)記探針。對PCR檢測呈陽性植株進(jìn)行Southern雜交檢測，方法按雜交試劑盒的操作指南進(jìn)行。

1.2.3.3 Western blot檢測 采用PBS提取緩沖液（NaCl 137 mmoL/L，KCl 2.7 mmoL/L，Na2HPO410 mmoL/L，KH2PO41.76 mmoL/L，pH7.4）提取煙草葉片中總可溶性蛋白質(zhì)，用Bradford法測定可溶性蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE 電泳，采用半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上。將NC膜置于封閉液中封閉；漂洗，加入稀釋的His-tag標(biāo)簽抗體一抗孵育；漂洗，加入稀釋的羊抗兔-HRP（辣根過氧化物酶）二抗孵育；漂洗，使用ECL Western blot Kit進(jìn)行ECL反應(yīng)；X-光片壓片，曝光、顯影、定影。

1.2.4 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的總可溶性蛋白生物活性檢測 參照文獻(xiàn)［14，15］將雄性昆明小鼠禁食12-18 h后，檢測基礎(chǔ)血糖值，挑選血糖值相近的小鼠分成2組，每組8只。分為對照組和給藥組，對照組按體重腹腔注射50%葡萄糖溶液同時給予野生型煙草總可溶性蛋白提取液，給藥組按體重腹腔注射50%葡萄糖溶液同時給以待測樣品。

尾靜脈取血測定血糖值，并記錄血糖值變化的差異。所有數(shù)據(jù)以±s表示，以SPSS12進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計組間差異。

2 結(jié)果

2.1 煙草外植體的選擇培養(yǎng)和抗性再生

經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染煙草小葉塊在不定芽分化的選擇培養(yǎng)過程中，大部分外植體黃化甚至白化逐漸死亡，小部分則仍然正常生長分化。15-20 d左右，開始有部分外植體分化出不定芽。取1 cm以上的抗性不定芽轉(zhuǎn)入附加30 mg/L Km選擇壓的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，最終獲得hGLP1基因轉(zhuǎn)化的煙草再生植株10株。

2.2 煙草抗性再生植株的PCR擴(kuò)增檢測

分別提取10個株系的轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片基因組DNA，采用hGLP1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，同時以PBI121-GLP1質(zhì)粒DNA為陽性對照，未轉(zhuǎn)化野生型煙草總DNA為陰性對照。結(jié)果（圖2）顯示，其中6個株系的轉(zhuǎn)基因煙草和陽性對照均擴(kuò)增出了150 bp左右目的條帶，而未轉(zhuǎn)基因野生型煙草則沒有特異性擴(kuò)增條帶。從而證實(shí)hGLP1基因已經(jīng)成功整合到煙草基因組DNA中。

2.3 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的GUS組織化學(xué)染色

對轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草再生植株莖葉做GUS表達(dá)檢測，以未轉(zhuǎn)基因野生型煙草作為陰性對照。結(jié)果（圖3）顯示，在轉(zhuǎn)基因煙草的莖和葉脈中有明顯的藍(lán)斑陽性信號，而野生型煙草則無GUS藍(lán)斑信號。從而證明GUS報告基因在轉(zhuǎn)基因煙草中獲得翻譯表達(dá)。由于hGLP1基因和GUS報告基因串聯(lián)或構(gòu)成融合基因，報告基因的表達(dá)間接證明hGLP1基因也能夠在轉(zhuǎn)基因煙草中正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.4 Southern blot檢測

以含有hGLP1基因的質(zhì)粒DNA為陽性對照，野生型煙草總DNA為陰性對照，對轉(zhuǎn)化植株樣本進(jìn)行Southern雜交檢測。結(jié)果（圖4）顯示，6個轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草抗性再生株系均出現(xiàn)明顯的陽性雜交信號。進(jìn)一步證明hGLP1基因已成功整合到煙草的基因組DNA中，獲得了轉(zhuǎn)人胰高血糖素樣肽1基因的轉(zhuǎn)基因煙草。將Southern雜交檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行擴(kuò)繁，煉苗后移栽至溫室，以便進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和生物活性檢測。

2.5 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的Western雜交檢測

由于hGLP1基因序列中融合有6×His-tag標(biāo)簽，在檢測轉(zhuǎn)基因煙草是否翻譯表達(dá)hGLP1融合蛋白的Western雜交檢測中，以Anti-His tag Antibody作為第一抗體，羊抗兔-HRP為二抗，以野生型煙草總可溶性蛋白作為陰性對照，分別提取6個株系的轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的總可溶性蛋白進(jìn)行Western雜交檢測。結(jié)果（圖5）顯示，在2個株系轉(zhuǎn)基因煙草中可以檢測到hGLP1融合蛋白的表達(dá)而在非轉(zhuǎn)基因的野生型煙草中沒有檢測到特異性雜交條帶。從而證實(shí)了hGLP1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中獲得了翻譯表達(dá)。隨著壓片時間的延長，非特異性條帶開始出現(xiàn)。

2.6 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白的生物活性

提取轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白，以昆明小鼠葡萄糖性高血糖模型進(jìn)行體內(nèi)生物活性檢測。葡萄糖對照組注射50%葡萄糖溶液，同時給以野生型煙草總可溶性蛋白提取液，給藥組注射50%葡萄糖溶液，同時給以轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白提取液。統(tǒng)計結(jié)果（表1）顯示，對照組和給藥組腹腔注射18 mmol/kg的50%葡萄糖溶液，10 min后小鼠血糖濃度迅速升高4 7倍，說明試驗(yàn)性高血糖模型造模成功。給藥組小鼠腹腔注射18 mmol/kg的50%葡萄糖溶液同時給以7.5 mg/kg的總可溶性蛋白，在隨后的10、20、40 min時小鼠血糖濃度均明顯低于葡萄糖對照組。初步證明轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草的總可溶性蛋白具有一定的降血糖生物活性。

3 討論

hGLP1基因由本課題組根據(jù)植物偏愛密碼子對堿基序列的優(yōu)化修飾，在基因序列上游添加了在翻譯的起始中有重要作用KOZAK序列［16］，以增強(qiáng)目的基因的翻譯效率，期待能夠在轉(zhuǎn)基因煙草植株內(nèi)高效表達(dá)人胰高血糖素樣肽1。

在煙草的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，通過抗生素篩選獲得再生植株仍有相當(dāng)一部分假陽性植株，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程中葉片常常卷翹變形而沒有完全接觸到選擇培養(yǎng)基，從而造成部分假陽性植株的篩選逃逸。也可能隨著培養(yǎng)時間增長，培養(yǎng)基中抗生素逐漸降解導(dǎo)致濃度降低，從而造成假陽性植株的再生。因此，在選擇培養(yǎng)的過程中保證葉片外植體充分接觸選擇培養(yǎng)基，經(jīng)常更換新鮮的培養(yǎng)基，優(yōu)先選取最早分化的抗性芽進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)，可望提高選擇效率。在Western雜交檢測中，僅有2個株系能夠檢測hGLP1融合蛋白的表達(dá)，其余4個株系沒有獲得陽性信號。由此可見，不同轉(zhuǎn)化子之間外源蛋白表達(dá)與否及表達(dá)量是存在明顯差異。究其原因可能是發(fā)生基因沉默，或是外源蛋白表達(dá)量太低不足以檢測到陽性信號，也可能是表達(dá)的外源蛋白在植物體內(nèi)被降解。外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)量低是普遍存的問題，有時甚至發(fā)生基因沉默而不能表達(dá)［17］。Yasud等［18］將GLP1基因?qū)胨局?，發(fā)生基因沉默而未獲得胰高血糖素樣肽1的表達(dá)，隨后他們將GLP1與GFP基因構(gòu)建融合序列轉(zhuǎn)化水稻，獲得高效的表達(dá)融合蛋白，但分離純化的過程中GLP1蛋白丟失，分析認(rèn)為可能是被細(xì)胞內(nèi)水解酶消化。

表1 轉(zhuǎn)hGLP1基因煙草總可溶性蛋白的生物活性（血糖濃度單位：mmol/L）

以模式植物煙草作為生物反應(yīng)器的受體，比較高效的遺傳轉(zhuǎn)化效率是其最大優(yōu)點(diǎn)。但是也存在著一定的問題，主要表現(xiàn)為煙草中含有大量的尼古丁等生物堿毒素，毒性較大，4 0 60 mg劑量即可使人致死［19］。以煙草作為生物反應(yīng)器表達(dá)的藥用蛋白無法直接使用，需精細(xì)純化后才能應(yīng)用。本研究中提取煙草總可溶性蛋白測試小鼠體內(nèi)生物活性發(fā)現(xiàn)，無論是對照組還是給藥組小鼠注射煙草總可溶性蛋白提取液后不斷顫抖，可能是煙草中生物堿毒素所致，下一步將采用分離純化的hGLP1融合蛋白進(jìn)行動物體內(nèi)生物活性檢測。分離純化轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的重組藥用蛋白，無疑會大大提高重組藥用蛋白的生產(chǎn)成本，不符合植物生物反應(yīng)器廉價地生產(chǎn)重組藥用蛋白的主旨。盡管目前已經(jīng)有多種植物被用作生物反應(yīng)器的受體來生產(chǎn)藥用蛋白、重組疫苗，如煙草、 谷類作物、 豆類、 蔬菜與根莖類作物等，但是還沒有找到公認(rèn)的最好的適于商業(yè)生產(chǎn)的植物物種和組織［20］。

4 結(jié)論

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染轉(zhuǎn)化，hGLP1基因已成功地整合到煙草基因組中并獲得轉(zhuǎn)化再生植株，hGLP1融合蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中獲得表達(dá)，初步的動物試驗(yàn)表明該融合蛋白具有一定的降血糖生物活性。

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