甲醇利用型吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌的篩選及鑒定

徐文 許然 張利平

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點實驗室，保定 071002）

吡咯喹啉醌（PQQ）是一種陰離子水溶性醌類化合物，是葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的輔酶。PQQ于20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)，1979年被Durine分離得到，隨后Salishuryt通過X線衍射技術(shù)闡明這種化合物的結(jié)構(gòu)并命名［1］。2004年Kay等［2］人利用電子順磁共振法對綠膿假單胞菌所產(chǎn)生的乙醇脫氫酶輔基PQQ的原子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。PQQ有多種生理功能，它能夠抑制過氧硝酸鹽的表達(dá)，防止齲齒類動物中風(fēng) ，刺激神經(jīng)生長因子生成、參與醌蛋白酶電子傳遞、增強(qiáng)微生物對極端環(huán)境的適應(yīng)力以及促進(jìn)植物的生長［3-5］，使其在食品業(yè)、輕工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等方面具有重要的開發(fā)前景。目前PQQ造價昂貴，化學(xué)合成方法步驟繁雜，產(chǎn)率低，副產(chǎn)物多，污染嚴(yán)重，后續(xù)處理困難。而微生物發(fā)酵法以甲醇為唯一碳源，培養(yǎng)基以無機(jī)化合物為主，這有利于產(chǎn)品的提取，所需成本低，國外也有報道有人曾利用生絲微菌生產(chǎn)PQQ，所以發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ在實際產(chǎn)業(yè)化中具有重要意義［6-8］。黏細(xì)菌是一類可滑行的革蘭氏陰性桿菌，虎杖內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富，根據(jù)已有的報道，PQQ產(chǎn)生菌多為革蘭氏陰性細(xì)菌［6］。本研究從160株虎杖內(nèi)生細(xì)菌和黏細(xì)菌中共篩選到4株甲基利用型PQQ產(chǎn)生菌，編號分別為083114、083129、95001和95032，分別對其PQQ產(chǎn)量進(jìn)行測定，對其同源性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 虎杖內(nèi)生細(xì)菌100株和黏細(xì)菌60株，均為本實驗室分離獲得并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基（1）完全培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0。（ 2）基本培養(yǎng)基：（NH4）2HPO43 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl l g/L，煙酸20 μg/L，VBl10 μg/L，VB220 μg/L，泛酸鈣 20 μg/L，吡哆醇 20 μg/L，生物素10 μg/L，對氨基苯甲酸10 μg/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eS04·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L。（3）MPQ 培 養(yǎng) 基：MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO43 g/L，檸檬酸鐵 30 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl2·4 H2O 0.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 5 mg/L，CuSO4· 5H2O 0.5 mg/L。

1.1.3 主要儀器和試劑 HPLC為HITACHI L-2455； Thermo ODS反相C18分析柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；PQQ標(biāo)準(zhǔn)品系Sigma公司產(chǎn)品（>98.6），其他均為市售生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 PQQ產(chǎn)生菌的初篩 將供試菌株分別接種于裝有10 mL 1%無水甲醇的完全培養(yǎng)基和1%無水甲醇的基本培養(yǎng)基的50 mL發(fā)酵管中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7 d，觀察菌體生長情況，選擇發(fā)酵液顏色由清澈變?yōu)榧t色的菌株。

1.2.2 發(fā)酵液中PQQ的提取 挑取初篩獲得的菌株的單菌落，接入裝有10 mL MPQ 培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 h，然后將全部培養(yǎng)液倒入裝有 50 mL MPQ 培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng) 7 d。

真空抽濾器抽濾去菌體，上清液中加入3倍體積的無水甲醇過夜，10 000 r/min 離心 20 min 取上清，pH調(diào)至3.5。

1.2.3 PQQ的光譜法分析 參照楊延新的方法［9］，將PQQ 產(chǎn)物分別加入石英和玻璃比色杯中進(jìn)行紫外掃描，以MPQ培養(yǎng)基加入3倍體積甲醇液為對照，記錄D326nm和D400nm值，計算OD326nm-OD400nm值用以檢測PQQ含量。

1.2.4 PQQ的HPLC分析條件 流動相：甲醇∶水為80∶20；流速：0.5 mL/min；檢測波長：213 nm；柱溫：29℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5 PQQ產(chǎn)生菌的鑒定 虎杖內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)36 h后進(jìn)行革蘭氏染色并觀察菌體形態(tài)。黏細(xì)菌培養(yǎng)36 h后，于解剖鏡觀察子實體形態(tài)，每隔24 h觀察一次。

菌株的16S rRNA基因序列測定參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。使用細(xì)菌通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1525r（5'- AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京三博生物技術(shù)公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，使用MEGA軟件（Version 5.05）及Neighbor joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PQQ產(chǎn)生菌的初篩

從160株供試菌株中初篩獲得16株發(fā)酵后培養(yǎng)液變?yōu)榧t色的的菌株，其中虎杖內(nèi)生細(xì)菌10株，其編號為083113、083114、083129、083142、083153、091417、091421、091423、091424和092610。黏細(xì)菌6株，其編號為95001、95011、95032、95041、95046和95047。

2.2 PQQ的光譜法分析

光譜學(xué)分析法通過計算OD326nm-OD400nm值用以檢測PQQ含量，菌株091417和菌株091423的OD326nm-OD400nm為負(fù)值，說明此2株菌株不產(chǎn)生PQQ（表1），選擇OD326nm-OD400nm值大于0的14株菌進(jìn)行HPLC色譜分析。

2.3 PQQ的HPLC定量分析

通過HPLC分析，樣品色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品相同，通過色譜峰面積進(jìn)行了定量分析（圖1）。結(jié)果共篩選得到甲基利用型PQQ產(chǎn)生菌4株，編號分別為083114、083129、95001和95032，通過對色譜峰面積的定量分析其PQQ產(chǎn)量分別為64.340、3.344、4.427和8.342 mg/L。

2.4 PQQ產(chǎn)生菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株95001分離自福州圓柏樹葉，其子實體在樹葉基質(zhì)上為球形，暗紅色，表面干燥，無折光性。CAS液體發(fā)酵液中，菌體為圓球形，沿壁生長，產(chǎn)紅棕色色素。

表1 16株供試菌株的光譜法分析測定結(jié)果

菌株95032分離自福州假蘋婆樹皮，其子實體在樹皮基質(zhì)上為橢球形，頂端尖，略帶亮黃色，基部土黃色，發(fā)暗。CAS液體發(fā)酵液中，菌體呈絮狀，沿壁生長，產(chǎn)黃色色素。

菌株083114革蘭氏陽性，菌體細(xì)胞桿狀，芽孢橢圓形，近末端，菌落透明，表面光滑透亮，邊緣整齊。

菌株083129革蘭氏陰性，短桿菌，不形成芽孢，菌落半透明，光滑濕潤，圓形邊緣整齊。

2.4.2 PQQ產(chǎn)生菌16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增4株P(guān)QQ產(chǎn)生菌的16S rRNA基因序列，經(jīng)北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。通過在GenBank中進(jìn)行同源性序列搜索及比對，從中選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示083114為芽孢桿菌（Bacillus. sp），083129為無色桿菌（Achromobacter. sp），95001和95032均為黏球菌（Myxococcus. spp）。

3 討論

本研究從160株供試菌株中篩選得到134株甲醇利用型菌和4株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，其中菌株95032的PQQ產(chǎn)量為8.342 mg/L ，菌株083114的PQQ產(chǎn)量甚至高達(dá)64.34 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出已報道的野生菌的PQQ產(chǎn)量，且這一結(jié)果是野生菌未經(jīng)誘變選育且未進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化得到的。培養(yǎng)條件對PQQ的產(chǎn)量影響甚大，如某些微量元素和甲醇的含量等對PQQ生物合成具有顯著影響［6］。可以預(yù)見，發(fā)酵條件經(jīng)適當(dāng)優(yōu)化或?qū)Υ藘芍昃M(jìn)行遺傳改造其PQQ產(chǎn)量也會相應(yīng)提高。

已報道的可產(chǎn)生PQQ的微生物種屬包括副球菌屬（Paracoccus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、甲烷單胞菌屬（Methanomonas）、甲基芽孢桿菌屬（Methylobacillus）、等［11］，國內(nèi)外尚未見有關(guān)黏球菌屬（Myxococcus）產(chǎn)生PQQ的報道。

根據(jù)以往的報道，PQQ高產(chǎn)菌株多為革蘭氏陰性菌株，一般情況下，野生菌的PQQ產(chǎn)量多為2-3 mg/L［6］，而本研究篩選到的可產(chǎn)生64.34 mg/L PQQ的野生型菌株083114，與革蘭氏陽性細(xì)菌酸快生芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。菌株95032在發(fā)酵過程中多糖產(chǎn)量高達(dá)0.3 g/L，菌株95001的多糖甚至高達(dá)0.8 g/L，在發(fā)酵液離心過程中會有部分PQQ被多糖沉淀包裹而損失，這一特性阻礙了PQQ的提取和純化及PQQ產(chǎn)量測定。可以推測，多糖被有效去除菌株95032和95001的PQQ產(chǎn)量會相應(yīng)提高。

4 結(jié)論

從160株虎杖內(nèi)生細(xì)菌和黏細(xì)菌中篩選到4株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，分別屬于芽孢桿菌、無色桿菌和黏球菌。其中芽孢桿菌083114的PQQ產(chǎn)量高達(dá)64.34 mg/L。

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