功能化葡聚糖用于三維細胞培養(yǎng)及發(fā)展前景

朱長皓，張?zhí)熘?，胡克，張啟英，郭兆彬，顧?/p>

(東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇南京 210009)

大部分的細胞培養(yǎng)研究都在二維表面進行，如微孔板、組織培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿［1-3］，該方法簡單、快捷、細胞存活率較高。這種傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)明顯地促進了對細胞生物學的理解，但同時也存在缺點。在體內，幾乎所有的組織細胞都生活在細胞外基質(ECM)中，這些ECM包含了復雜的三維纖維網(wǎng)絡，提供復雜的生物和物理信號［4］。二維基板在模擬三維微環(huán)境這方面有所限制，因為缺乏一定的結構和材料的局限性。此外，生長在二維剛性基板上的細胞需要有相當大的適應性，因為其缺乏特定的ECM。這些缺點可能會改變細胞的新陳代謝，降低其相應的功能。出于這個原因，二維細胞培養(yǎng)不僅影響細胞復雜的動態(tài)的生長環(huán)境，而且有可能歪曲實驗結果，因為這是強制細胞適應這種環(huán)境而獲得的檢測結果［5-7］。三維細胞培養(yǎng)基質或者稱為支架，克服了二維的限制，這些基質或者支架都是多孔結構，可以支持細胞生長、繁殖和分化。材料的多樣性和可塑性在三維基質中更加突出，需要考慮一定的孔隙率、透氣性能、納米尺度的表面形貌。

1 材料標準

人工三維細胞培養(yǎng)基質設計的最終目標是充分模擬體內的ECM結構，使得體外細胞生活的環(huán)境和其在體內相似。ECM是由細胞產(chǎn)生并分泌到細胞外周質中的物質，主要包括纖維成分(如膠原和彈性蛋白)、連接蛋白(如纖連蛋白等)和填充分子(通常是糖胺聚糖)等。這些獨特的成分和結構提供相應的生物物理和生化功能，如促進可溶性信號分子，營養(yǎng)和代謝廢物的運輸，并提供機械性能［8］。ECM和細胞之間的作用是動態(tài)的、相互的，ECM可以引導細胞向特定的方向分化，細胞也會回饋它們的生存環(huán)境，通過降解和合成新的ECM來重塑生存環(huán)境［9-10］。

三維基質結構必須有一定的尺度，這點對于模仿生物系統(tǒng)非常重要，因為大自然衍生出的性質往往源于多尺度、多層次結構［11］。在這里，我們定義三維細胞基質有3種尺度:宏觀尺度(10-1～10-3m)、微觀尺度(10-3～10-6m)、納米尺度(10-6～10-9m)。宏觀尺度結構決定了基質的特性包括大小和形狀，對于體外三維細胞培養(yǎng)應用，大小和形狀決定了其方便性和功能性［12］。在微觀尺度上的可控性對于模擬微組織結構是相當有價值的，如ECM中的多細胞空間結構。雖然微型結構應該針對于不同的部位，但是基本的設計參數(shù)如孔隙度、孔隙的連通性、幾何形狀、孔隙分布以及表面形貌是共通的［13］。微觀結構影響三維細胞中物質的運輸便利。此外，微觀尺度的表面特性可以激活某些基因或者調解細胞的增殖和分化，因為細胞和ECM之間通過納米尺度的蛋白質進行作用，調解各種細胞活動來維持ECM環(huán)境［14］。因此，特別注意納米尺度的設計是無可厚非的，大部分ECM成分都是納米級的。例如膠原纖維的直徑在50～200 nm，纖維連接蛋白長60～70 nm，厚3 nm［15］。除了微量營養(yǎng)的供給，納米尺度的結構特點提供了對大部分細胞功能有影響的表面形貌。這并不奇怪，因為許多細胞信號機制涉及到納米尺度的分子，納米尺度的表面已經(jīng)被證實可以調解細胞黏附、組織形態(tài)和分化［16］。

目前用于三維細胞培養(yǎng)的材料分為天然材料和合成材料兩種(表1)［17］，這些材料的先天屬性已經(jīng)通過檢驗，但是想要模擬ECM結構，我們需要了解以下一些參數(shù):(1)生物相容性，這是一個關鍵的參數(shù)，因為它決定了細胞對于材料的適應性，即細胞不會引起明顯的排異反應。天然材料往往表現(xiàn)出比合成材料更好的生物相容性，但是由于動物源提高了疾病傳染的可能。合成材料制造過程更加嚴格，盡可能少使用帶毒性化學藥品來保證其生物相容性［18］。(2)潤濕性。由于自然的ECM是完全的水合凝膠，潤濕是一個重要的因素。更多的親水性材料對于模擬體內環(huán)境比較好，出于這個原因，水凝膠已經(jīng)被廣泛用于三維細胞培養(yǎng)，但是水凝膠的親水性阻礙了細胞在其表面的黏附，為了克服這一缺點，有人采用在這些材料表面嵌入RGD短肽，以促進細胞在其表面黏附［19］。(3)透明度。細胞體外三維培養(yǎng)需要顯微鏡的觀察，因此必須考慮到材料的透明度。許多傳感和定量分析技術，如染色和酶聯(lián)免疫吸附試驗同樣也要使用光學儀器，還包括共聚焦顯微鏡。因此，透明材料有利于光信號通過而沒有光束消散［20］。(4)可控的生物降解性。不管是植入人體還是體外培養(yǎng)細胞，最后都必須消除這些支架。一般來說，合成材料通過水解而天然材料通過酶降解，水降解比酶降解更有可預見性和可調節(jié)性，天然材料的酶降解更依賴于該酶的濃度［21］。(5)機械性能。細胞培養(yǎng)基質的機械性能幾乎全部體現(xiàn)在材料上，這一點在組織工程中體現(xiàn)比較強烈。例如，骨再生支架如果不能承擔足夠的負荷，就有可能在骨愈合之前斷裂。然而，過度強大的機械性能破壞相鄰的骨組織結構［22］。因此，三維細胞培養(yǎng)基質的選擇需綜合以上各個因素，才能更完美地模擬出細胞生長的環(huán)境。

表1 三維細胞培養(yǎng)常用材料

2 功能化葡聚糖三維支架

在眾多材料中，葡聚糖是天然的、非動物源的多糖分子，它不是單糖而是低聚糖，葡聚糖按照組成它的單糖——葡萄糖的單元數(shù)目分為葡聚糖100 K、葡聚糖40 K和葡聚糖20 K等系列聚合物。葡聚糖分子式為［C6H10O5］n，結構式見圖1。

圖1 葡聚糖結構式

它難溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機溶劑，本身雖然抗蛋白質吸附和細胞黏附，但其結構中含有豐富的羥基官能團，使得它易于化學修飾，已經(jīng)被廣泛用于二維或者多孔軟組織支架、藥物釋放等領域。它來源廣泛、價格便宜，可以通過酶來降解，完全可以用來作為三維細胞培養(yǎng)的材料［23-26］。

2.1 葡聚糖凝膠

新加坡南洋理工大學劉云蕭利用葡聚糖進行改性合成DEX-MA-AD，使用紅外和核磁對此進行了表征，并于平滑肌細胞進行三維封裝培養(yǎng)。證明了葡聚糖明膠交聯(lián)的凝膠具有較高的彈性模量，也適合平滑肌細胞的三維培養(yǎng)和內皮細胞的二維培養(yǎng)。使用葡聚糖的雙官能管與甲基丙烯酸甲酯改性，醛基與明膠上的氨基結合，紫外光交聯(lián)形成凝膠與血管平滑肌細胞封裝培養(yǎng)。以Dex-MA-AD為主要成分的水凝膠的彈性性能明顯優(yōu)于以PEG為主材料的水凝膠(圖2)。而明膠納入水凝膠中增加了細胞黏附性和酶降解性，并且增加了抗壓強度，通過希夫堿來改變凝膠的交聯(lián)密度。實驗發(fā)現(xiàn)，水凝膠促進血管內皮細胞在二維培養(yǎng)條件下的黏附性以及三維培養(yǎng)條件下平滑肌細胞的傳播，血管增生長達14 d。這種水凝膠的力學性能對于2D和3D培養(yǎng)都具有吸引力，是一種很有前途的細胞培養(yǎng)基質［27］。

圖2 合成Dex-MA-Ly示意圖

中國科學院的蔡琴等利用葡聚糖和聚乳酸進行混合，他采用的是溶劑鑄造法，將葡聚糖和PLA溶于二氯甲烷和笨的混合物中，但首先葡聚糖先進行TMS的保護，葡聚糖的羥基可以通過甲醇很容易去除TMS的保護而恢復。通過此方法形成具有微孔結構的薄膜，它是由于相分離而形成的，因為PLA和TMSD在二氯甲烷和苯的混合液中的溶解度不同。通過這種技術，PLA和聚乳酸-葡聚糖混合支架就制作出來了，采用粒子浸出法出現(xiàn)了5～10 mm的微孔，這導致支架具有較高的孔隙率和開放多空結構。通過比較純PLA和聚乳酸-葡聚糖，后者表面親水性明顯改善，它具有良好的細胞親和性和生物相容性，增強細胞的黏附效率，促進細胞增殖滲透到支架內部并進行增殖，這種材料也是非常具有潛在前途的細胞支架［28］。

另外，加拿大的Ryan M.Lima小組利用葡聚糖和PEG不混溶性，期間葡聚糖與甲基丙烯酸酯進行交聯(lián)。通過控制葡聚糖的甲基丙烯酸甲酯的取代程度，葡聚糖的摩爾質量和PEG的濃度創(chuàng)造了大孔水凝膠，溶液中PEG的存在對于葡聚糖凝膠的最后形態(tài)具有非常重要的影響，導致形成了不同類型的結構形態(tài)，從微孔凝膠到大孔凝膠到相互連接的串珠狀結構，一系列的配方圖表編制使得他們確定哪種條件才能得到相互關聯(lián)的串珠狀結構。葡聚糖大孔串珠狀結構含有很高的水分，在89%到94%之間，通過電鏡表征形態(tài)均勻。這種支架將在小鼠3T3成纖維細胞培養(yǎng)中具有重要的作用，可以調查細胞滲透、細胞間相互作用［29］。

2.2 葡聚糖微載體

微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)是一種用于高產(chǎn)量培養(yǎng)貼壁細胞的實用技術。CytodexTM專用于培養(yǎng)各類動物細胞，其培養(yǎng)體積可以從數(shù)毫升到6 000 L以上。應用Cytodex微載體技術，可以實現(xiàn)簡單的貼壁細胞(CHO、Cl27、Vero、COS、CV-1 等)懸浮化培養(yǎng)，每毫升培養(yǎng)液可得到數(shù)百萬細胞。微載體適于搖瓶、轉瓶、攪拌罐以及WAVE生物反應器等各種培養(yǎng)系統(tǒng)。Cytodex的設計能夠滿足微載體技術的特殊需要。它的特點有:(1)Cytodex的大小和密度經(jīng)優(yōu)化處理，以保證培養(yǎng)各類細胞時使其生長良好，產(chǎn)量提高。(2)培養(yǎng)基架為生物學惰性，可為懸浮微載體培養(yǎng)提供堅實而非剛性的培養(yǎng)面。(3)微載體透明，可直接使用顯微鏡觀察或染色后觀察。

Cytodex 1以交聯(lián)葡聚糖基架(cross-linked dextran matrix)為基礎，該基架被帶正電荷的N，N二乙胺基乙基基團(N，N-diethylaminoethyl groups)取代，該帶電基團遍布于整個微載體基架中。

Cytodex 3含有一層較薄的變性膠原，與交聯(lián)葡聚糖基架化學偶聯(lián)。Cytodex3上的變性膠原層易被胰蛋白酶和膠原酶等多種蛋白酶消化，因此，能在維持細胞最大活性、功能和完整性的同時將細胞從微載體上分離出來。Cytodex技術為進行動物細胞的培養(yǎng)提供了新的選擇，該微載體為動物細胞的生長提供了適宜的表面，并可用于懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，還可用于增加單層細胞培養(yǎng)容器(例如培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶)及灌注室(perfusion chambers)中的細胞產(chǎn)量。其應用范圍為大量生產(chǎn)各類細胞、病毒及重組細胞產(chǎn)物(例如干擾素、酶、核酸、激素);研究細胞貼壁、分化及細胞功能;灌注柱式培養(yǎng)系統(tǒng)(perfusion column culture systems);顯微鏡檢查研究;獲取有絲分裂細胞;分離細胞;膜研究;細胞的保存和運輸，細胞遷移的檢測及標記化合物的攝取研究［30］。

2.3 環(huán)境響應型葡聚糖

很久以來人們一直在試圖通過控制凝膠體積對環(huán)境刺激的響應性來提高多糖凝膠的生物性能，因為溫度敏感的葡聚糖凝膠能夠對環(huán)境溫度的變化產(chǎn)生響應，因而可以用來提高藥物釋放的效率，特別是對生物體內葡聚糖酶含量的地方進行靶向釋放時的效率。

天津工業(yè)大學的肖飛等在N-異丙基丙烯酰胺凝膠中引入葡聚糖，期望在保留PNIPA的溫度敏感性的基礎上改善凝膠的生物相容性和力學性能，使其具有更加廣泛的應用。聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠在＞32℃時呈收縮構象，分子表面呈疏水性，在溫度＜32℃時呈伸展構象，分子表面呈親水性。據(jù)此，通過調節(jié)溫度可以改變固體表面的親水性。他成功合成了N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)與葡聚糖的共聚水凝膠，研究了凝膠的溶脹行為，并對其細胞相容性進行研究。通過控制溫度的變化，實現(xiàn)凝膠材料對細胞層的自然脫附，避免酶解法對細胞功能的損傷［31］。

此外還有一些通過接枝光敏感性分子、pH敏感分子等來改性葡聚糖，以獲得環(huán)境敏感型基質。

3 未來的發(fā)展

三維細胞培養(yǎng)基質從根本上代表了生物醫(yī)學工程的發(fā)展，已經(jīng)取得了相當大的成功，但是也提出了新的挑戰(zhàn)。三維細胞培養(yǎng)的趨勢是由經(jīng)驗之談上升到系統(tǒng)的認證方法，這就需要發(fā)展更加先進的三維細胞培養(yǎng)基質結合生物醫(yī)學工程技術。同時，必須努力地制定三維細胞基質的標準，盡管三維培養(yǎng)的獨特優(yōu)勢已經(jīng)有所體現(xiàn)，但是仍然沒有像二維培養(yǎng)那樣在研究領域被廣泛接受，因為三維細胞培養(yǎng)基質的結構和組成的偏差，每次使用的基質可能在成分上有微小的區(qū)別，很難重復得到完全一樣的ECM，這就很難重現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)，難以進行系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析［32-35］。另外一個抑制其廣泛應用的實際原因是制備成本巨大，很難大范圍推廣使用。為了彌補這些，必須建立一定的標準，來促使研究人員充分利用三維細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢。建立體外三維標準化細胞培養(yǎng)，對篩選新藥物，研究癌細胞的發(fā)病機理具有相當大的幫助，而且可以盡可能地減少動物和人體臨床試驗［34-36］。以下是作者對此技術的一點看法和建議:(1)細胞播種方法需要加以改進，必須知道均勻分布在三維基質中的細胞的精確數(shù)量，因為細胞的數(shù)目影響支架與支架之間的實驗結果比較。(2)目前的細胞培養(yǎng)液應該加以重新考慮，因為培養(yǎng)基成分的突然變化會擾亂預先存在的可溶性的信號分子的濃度和分布梯度。(3)目前所有的培養(yǎng)模式都比較溫和，沒有考慮到外界的機械刺激和電刺激，而體內環(huán)境則有一定的機械壓力及電荷分布，可以通過一定的外界刺激來探討細胞的生長狀況。(4)目前三維細胞分析方法必須加以改進，包括共聚焦和micro-CT圖像分析。這些改良必將影響三維細胞培養(yǎng)的效果，并加速滲透到其他領域的應用。(5)除了上述部分，一套獨特的實時監(jiān)測細胞生活狀態(tài)的技術是未來發(fā)展的方向［37-38］。

4 總 結

以模擬天然細胞的生活環(huán)境為目的的三維細胞培養(yǎng)技術，推動了材料和制造技術的發(fā)展。在三維細胞培養(yǎng)過程中，材料的形態(tài)和制作都在不斷研制，對于任何細胞都適用的理想的三維細胞培養(yǎng)標準仍待建立。因此，三維細胞培養(yǎng)的重要性和必要性在組織和細胞生物學領域被廣泛報道，使用三維細胞培養(yǎng)基技術獲得有意義的數(shù)據(jù)是多學科集合的結果。解決這些挑戰(zhàn)的過程中會帶來細胞生物學的革命，從二維平面生物學轉向三維立體生物學，換句話說就是三維細胞培養(yǎng)將是生物醫(yī)學工程發(fā)展的關鍵。另外，葡聚糖以其獨特的優(yōu)勢，未來將在三維細胞培養(yǎng)基質的應用中占有一席之地。

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