丁文姣，李曉蓉，董 俊

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070）

土著菌種發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)利用周圍自然環(huán)境的生物資源，即采集本地土壤中的多種有益微生物，通過對這些微生物進行培養(yǎng)、擴繁，形成有相當活力的微生物母種，再合成菌劑用于發(fā)酵床養(yǎng)豬，菌劑的安全及可靠是其進行推廣的基礎與前提。為此，我們對前期分離篩選的土著菌種進行了安全性檢驗，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種為2010年7月至2011年4月從蘭州、武威、臨洮3地采集不同種類樣品的分離所得（見表1）和活力99生酵劑（市售）。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA），肉汁胨瓊脂（BPA），肉汁胨培養(yǎng)液。供試小白鼠為昆明系小白鼠，標準體重20 g左右，共100只，雌雄各半，購于蘭州大學。

表1 供試標樣來源

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離及純化 在超凈工作臺用滅菌器械挑取標樣1 g左右于滅菌錐形瓶內(nèi)，用無菌水定容到100 mL，震蕩20 min后靜置5 min，然后將其稀釋到質(zhì)量濃度為10-8g/mL，分別在10-4、10-6、10-8g/mL濃度下各取0.5 mL懸液平鋪于PSA平板上；再將10-2、10-4、10-6g/mL 3個濃度懸液80℃恒溫水浴處理30 min后各取0.5 mL平鋪于BPA平板上，每處理5個平板，37℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)好的平板，統(tǒng)計每個標樣所分離出菌種的類型計數(shù)，并挑取長勢良好的菌種劃線接入BPA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，在PSA平板上培養(yǎng)聞味初篩，挑取氣味不刺鼻的單菌落作為備選菌種保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種安全性毒力試驗 將備選菌種活化至PSA，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將活化好的菌種接種至肉汁胨培養(yǎng)液，37℃恒溫條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)好的菌液于血球計數(shù)板計數(shù)，計算1 mL菌液的活菌數(shù)。試驗設菌種接種為主處理（A），共9個，處理A1為用菌種JZ1接種2次，處理A2為用菌種JZ2接種2次，處理A3為用菌種JZ3接種2次，處理A4為用菌種JZ4接種2次，處理A5為用菌種JZ5接種2次，處理A6為用菌種JZ6接種2次，處理A7為用菌種JZ7接種2次，處理A8為用菌種JZ8接種2次（活力99生酵劑，菌種對照），處理⑨為不接種，空白對照。設接種處理方式和接種菌液量為副處理（B），共3個，處理B1為灌胃0.25 mL/只，處理B2為灌胃0.50 mL/只，處理B3為腹腔注射0.50 mL/只。每處理取6只小鼠（雌雄各3只），先用菌液濃度為5×108個/mL的菌種接種1次，飼養(yǎng)觀察14 d后再用菌液濃度為50×108個/mL的菌種接種1次，飼養(yǎng)觀察14 d。試驗前1 d給小鼠斷食斷水，接種處理好的小鼠1 h后正常喂食飲水，在20℃恒溫條件下飼養(yǎng)觀察。

表2 代表性菌種及來源

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離純化結(jié)果

通過對采集自蘭州、武威、臨洮3地不同樣源類型的19個樣品標本經(jīng)分離、純化，共獲得純化菌種167株。

2.2 菌種安全性評價

根據(jù)對功能菌的樣源地、樣品類型、產(chǎn)酶特點、生長狀況的綜合分析，選取前期試驗中獲得的具有代表性的土著功能菌種7株和商品菌種作為菌種對照布置毒力試驗，代表性菌種及來源見表2。

試驗結(jié)果（表3）表明，從菌種接種方面可以看出，第1次接種后飼養(yǎng)觀察14 d，各處理對小鼠采食狀況、飲水、行為能力以及體貌特征如毛況等均無影響，小白鼠均未出現(xiàn)死亡。第2次接種后飼養(yǎng)觀察14 d，各處理的小白鼠也均未出現(xiàn)死亡，采食和精神狀態(tài)良好。接種2次后各處理小白鼠的生長情況同接種前。試驗結(jié)束后剖解觀察小白鼠各臟器（如心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胃、腸、氣管、生殖器官等部位）均無病變且無出血點，表明所選7個土著菌種安全無毒。進一步將這些菌種對實驗動物小白鼠經(jīng)口灌胃法、腹腔注射法進行毒力試驗的結(jié)果表明，不同菌液用量灌胃處理和腹腔注射處理的小白鼠均未出現(xiàn)死亡，且采食狀況、行為能力以及精神狀態(tài)均無異常。綜合以上結(jié)果，試驗評價的7株土著功能菌種均安全可靠，可以用于豬發(fā)酵床制作接種并作為合成菌劑的備選菌種。

表3 選取菌種安全性試驗

3 小結(jié)與討論

1）試驗篩選出的7個土著菌種菌株均為甘肅地區(qū)土著功能菌種。試驗結(jié)果表明，不同菌液用量灌胃處理和腹腔注射處理的小白鼠均未出現(xiàn)死亡，且小白鼠采食狀況、行為能力以及精神狀態(tài)均無異常，即7株土著功能菌種均安全可靠，可以用于豬發(fā)酵床制作接種并作為合成菌劑的備選菌種，但今后尚需進一步擴大實驗動物數(shù)量，繼續(xù)進行長期的安全性評價。

2）發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)自近年傳入我國后，目前不分南北都有采用，商業(yè)公司宣傳為“生物環(huán)保養(yǎng)豬法”。但實際生產(chǎn)中存在許多客觀問題，因此，對合成菌劑的菌種在菌劑合成之前進行安全性風險評估，建立適合我國國情的菌種安全性評價體系，對保證發(fā)酵床養(yǎng)殖的安全性有重要的意義。