桉樹組培苗潛伏期和輕基質(zhì)中青枯菌的PCR快速檢測(cè)

王 艷，吳志華，李國(guó)清，謝耀堅(jiān)，周旭東,2

(1.國(guó)家林業(yè)局 桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江524022；2. 富優(yōu)基尼生物技術(shù)(上海)有限公司，上海 200235)

桉樹組培苗潛伏期和輕基質(zhì)中青枯菌的PCR快速檢測(cè)

王 艷1，吳志華1，李國(guó)清1，謝耀堅(jiān)1，周旭東1,2

(1.國(guó)家林業(yè)局 桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江524022；2. 富優(yōu)基尼生物技術(shù)(上海)有限公司，上海 200235)

桉樹青枯病是由Ralstonia solanacearum引起的一類土傳病害，具有發(fā)病快速不易防治等特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)桉樹組培苗和輕基質(zhì)帶菌情況的早期快速檢測(cè)，將不同濃度青枯菌懸液人工接種于桉樹組培苗和輕基質(zhì)中，利用特異性寡核苷酸引物OLI1/Y2，能快速的檢測(cè)出潛伏期組培苗，以及帶菌輕基質(zhì)中青枯菌的數(shù)量。試劑盒法提取基因組DNA后對(duì)其靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明：試劑盒法提取基因組DNA純度較高，通過微量分光光度計(jì)檢測(cè)出A260/A280均在1.7～1.9之間。桉樹組培苗組織和輕基質(zhì)中檢測(cè)限分別為102CFU/mL和103CFU/mL。因此，潛伏期PCR快速檢測(cè)法為預(yù)防病原菌的進(jìn)一步傳播提供了新的思路。

桉樹青枯?。粰z測(cè)靈敏度；組培苗；輕基質(zhì)；聚合酶鏈反應(yīng)法

桉樹青枯病是由勞爾氏菌Ralstonia solanacearum引起的能侵染50多個(gè)科200多種植物的一種細(xì)菌性土傳病害[1]。1982年，在我國(guó)廣西的柳桉E.saligna和巨桉E.grandis等幼樹上首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)[2]，此后在我國(guó)廣東、廣西、云南、海南以及臺(tái)灣等地相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)。病原菌散布在土壤內(nèi), 借流水、土壤以及病殘株等傳播[3]。在土壤中，病原菌具有極強(qiáng)的存活力，即使沒有寄主的存在，在適宜的溫度和環(huán)境下也能長(zhǎng)期存活[4]。病原菌可通過根的傷口或者次生根根冠部侵入寄主，然后通過木質(zhì)部繁殖擴(kuò)散[5]，破壞植物的維管束系統(tǒng)，造成植物迅速失水萎蔫、枯死。同時(shí)病原菌還能定殖于植物組織內(nèi)而不引起發(fā)病，與發(fā)病植株相比，潛伏期病原菌的傳播存在更嚴(yán)重的威脅[6]。

桉樹是我國(guó)重要的速生豐產(chǎn)林之一，自1890年引種栽培以來(lái)，我國(guó)桉樹人工林面積已達(dá)360萬(wàn)hm2，僅次于巴西和印度，位居世界第三[7]。隨著大規(guī)模桉樹人工林產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，高質(zhì)高產(chǎn)的無(wú)性繁殖技術(shù)，特別是組培快繁技術(shù)越來(lái)越多的被用于優(yōu)良品種的選育和規(guī)?；a(chǎn)中[8]。大面積單一桉樹無(wú)性系人工林的種植，導(dǎo)致病蟲害的問題日益嚴(yán)重，特別是桉樹青枯病的發(fā)生，給桉樹生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。為了有效的控制病原菌的傳播，建立一種桉樹組培苗潛伏期及輕基質(zhì)中青枯菌的快速檢測(cè)方法是十分必要的。血清學(xué)技術(shù)[10]及選擇性培養(yǎng)基[11-12]等傳統(tǒng)的檢測(cè)方法常被用于土壤及潛伏期帶菌組織的檢測(cè)，但是這些方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度較低及存在假陽(yáng)性等缺點(diǎn)，不能適應(yīng)植物檢疫和實(shí)驗(yàn)室快速鑒定的需要，因此，以核酸序列分析為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)方法的建立，大大提高了對(duì)青枯菌的檢測(cè)速度，這些方法可以直接從發(fā)病組織或者帶菌土壤中進(jìn)行病原菌的快速檢測(cè)，而不需要進(jìn)行病菌的分離及純培養(yǎng)，同時(shí)還能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到極微量的病菌。簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟的同時(shí)，也提高了檢測(cè)限和準(zhǔn)確度[13]。該研究利用Seal等[14]以16S rRNA為靶基因的青枯菌特異性引物OLI1/Y2，通過人工接種不同濃度桉樹青枯菌的處理方法，從桉樹組培苗及輕基質(zhì)中提取出基因組DNA后并PCR檢測(cè)，建立了一套桉樹組培苗潛伏期及輕基質(zhì)帶菌靈敏度PCR快速檢測(cè)方法，為防控病原菌的進(jìn)一步傳播提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 桉樹青枯菌的分離、純化及菌懸液的配制

供試菌株分離自廣西省合浦縣黑石嶺林場(chǎng)尾葉桉病株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確定其病原菌為Ralstonia solanacearum，病原菌純化后無(wú)菌水中室溫保存。病原菌活化培養(yǎng)采用CPG培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，水解蛋白1 g/L，酵母提取物1 g/L，瓊脂16 g/L，調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0，121 ℃ 滅菌20 min待用。

無(wú)菌環(huán)境下取一環(huán)已純化的菌株，劃線于CPG培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)后取流動(dòng)性強(qiáng)的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)36～48 h后，無(wú)菌水洗下菌體，10 000×g離心10 min，去除上清液，無(wú)菌水梯度稀釋后平板計(jì)數(shù)[15]。配成10～108 CFU/mL菌懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶；dNTPs；瓊脂糖；DNeasy Plant Mini Kit購(gòu)自 QIAGEN；MO-BIO PowerSoil DNA isolation Kit購(gòu)自寶杰羅生物科技有限公司；Nanodorp微量紫外分光光度計(jì)。

離心機(jī)；PCR儀；電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)；電泳槽；恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 桉樹組培苗中青枯菌DNA的提取

1.3.1 組培苗樣品的處理

桉樹組培苗無(wú)性系DH32-29由南方國(guó)家級(jí)林木種苗示范基地提供。取適量組培苗研磨后，分別稱取50 mg研磨組織于1.5 mL離心管中，加入200 μL配制好的青枯菌懸液，使其終濃度分別為10～108CFU/mL，無(wú)菌水對(duì)照。

1.3.2 DNA的提取

試劑盒法：取處理好的不同濃度研磨組織分 別 加 入 400 μL Buffer AP1 和 4 μLRNase A，渦旋混勻后65 ?C孵育10min，期間顛倒混勻2～3次。再加入130 μL Buffer AP2，混勻后冰上孵育5 min，20 000×g離心5 min。轉(zhuǎn)移上清到QIAshredder spin中20 000×g離心2 min，轉(zhuǎn)移濾液到新的離心管中，加入1.5倍體積的Buffer AP3/E混勻。轉(zhuǎn)移650 μL混合液到DNeasy Mini Spin中，6 000×g離心1 min，棄去濾液，重復(fù)此步驟直至過濾完所有混合液。將此Spin放置于新的離心管中，加入500 μL Buffer AW，20 000×g離心2 min。再次轉(zhuǎn)移Spin到新的離心管中，加入100 μL Buffer AE，室溫孵育5 min中后6 000×g離心1 min，重復(fù)此步驟，棄去Spin，此時(shí)收集管中的DNA冷凍保存(-20℃)可直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

1.4 桉樹組培苗輕基質(zhì)中青枯菌DNA的提取

1.4.1 輕基質(zhì)樣品前處理

由稻殼∶椰糠∶泥炭土等于5∶3∶2組成的桉樹組培苗輕基質(zhì)由由南方國(guó)家級(jí)林木種苗示范基地提供。將輕基質(zhì)放于室溫環(huán)境中風(fēng)干后121?C滅菌20 min待用。取滅菌基質(zhì)50 mg放于1.5 mL離心管中，分別加入10～108CFU/mL的菌懸液200 μL，室溫下孵育1 h。

1.4.2 DNA的提取

取處理好的樣品加入到PowerBead Tubes中，輕輕渦旋混勻，加入60 μL C1溶液，上下顛倒數(shù)次混勻。將PowerBead Tubes固定在渦旋儀上，調(diào)節(jié)最大轉(zhuǎn)速3 200 r/min，連續(xù)振蕩10 min后室溫10 000×g離心30 s。轉(zhuǎn)移上清至干凈的2 mL收集管中，再加入250 μLC2溶液到上清中，渦旋5 s，4℃孵育5 min后室溫10 000×g離心1 min。避開沉淀小珠，轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的收集管中，加入200 μLC3到上清中，渦旋混勻后4℃孵育5 min。室溫10 000×g離心1 min。再次轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的收集管中，加入1.2 mLC4溶液到上清中，渦旋混勻5 s，加載約675 μL上清到Spin Filter中，室溫10 000×g離心1 min。棄去濾液后繼續(xù)加載上清，重復(fù)直至過濾完所有上清。再在Spin Filter中加入500 μL C5后室溫10 000×g離心30 s，棄去上清室溫10 000×g離心1 min。小心轉(zhuǎn)移Spin Filter到2 mL Collection Tube中，盡量避免C5溶液污染，加入100 μLC6溶液到白色濾膜中心，室溫10 000×g離心30 s，棄去Spin Filter，此時(shí)收集管中的DNA冷凍保存(-20℃)可直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

1.5 PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)Seal等[14]結(jié)果設(shè)計(jì)引物，以16sRNA為靶基因的青枯菌特異性引物序列OLI1/Y2，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。序列如下：

OLI1:5′GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC3′

Y2 :5′CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT3′

PCR反應(yīng)體系及條件：PCR采用25 μL體系：10×Buffer 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、OLI1/Y2 各 1 μL、Taq 酶 0.5 U，模版 DNA1 μL，加 ddH2O至 25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，66℃復(fù)性20 s，72 ℃變性30 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

瓊脂糖凝膠電泳分析：1×TAE電泳緩沖液，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖膠上(已加入Gel Red染色劑)，60 V穩(wěn)定電壓分離，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹組培苗中青枯菌PCR檢測(cè)靈敏度的測(cè)定

將桉樹組培苗研磨組織人工接種不同濃度青枯菌后，采用試劑盒法提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1。從圖中可以看出，試劑盒法均能將菌量為102～108CFU/mL的桉樹組培苗染菌組織和陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出單一的特異性條帶，具有較高的檢測(cè)靈敏度，可以檢測(cè)出桉樹組培苗組織中最低102CFU/mL的青枯菌。

2.2 桉樹組培苗輕基質(zhì)中青枯菌PCR檢測(cè)靈敏度的測(cè)定

為測(cè)定桉樹組培苗基質(zhì)中青枯菌的PCR檢測(cè)靈敏度，將不同濃度的青枯菌菌懸液人工接種于風(fēng)干無(wú)菌組培苗輕基質(zhì)中，試劑盒法提取基因組DNA后PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明：PCR擴(kuò)增后103～108CFU/mL處理樣品及陽(yáng)性對(duì)照均能擴(kuò)增出單一的特異性條帶，即PCR檢測(cè)限最低達(dá)103CFU/mL。

圖1 桉樹組培苗中青枯菌PCR檢測(cè)靈敏度Fig 1 Sensitivity of PCR assay for detecting R. solanacearum in tissue culture seedlings of Eucalyptus

圖2 桉樹組培苗輕基質(zhì)中青枯菌PCR檢測(cè)靈敏度Fig 2 Sensitivity of PCR assay for detecting R. solanacearum in the substrates

3 結(jié)論與討論

Ralstonia solanacearum是一種土壤習(xí)居菌，主要在土壤中及遺落在土壤中的病殘?bào)w上越冬，也能在各種生長(zhǎng)著的寄主體內(nèi)及根際越冬，通常在土壤中存活數(shù)年之久，在濕潤(rùn)的土壤中可以存活二十年以上，干燥土壤中一般可以存活數(shù)十年。因此，為了進(jìn)一步控制病原菌的傳播，間接或直接的從自然發(fā)病植株和土壤中檢測(cè)青枯菌是常用的的檢測(cè)方法[16-18]，但是不同的影響因素導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度較低[19]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，快速、靈敏且重復(fù)性較好的PCR擴(kuò)增技術(shù)被廣泛的用于病原菌的快速檢測(cè)。其中，從植物或者土壤中提取出純化度較高的基因組DNA是檢測(cè)過程的重要步驟之一。王盛坤[20]、郝梁丞[21]等采用不同的DNA提取方法檢測(cè)土壤及桉樹組織中的青枯菌，均能達(dá)到較高的靈敏度，不同的DNA提取方法檢測(cè)限不同[22-24]。但是綜合目前的研究，由于植物組織中的酚類和多糖物質(zhì)以及土壤中含量較高的腐殖酸都是影響DNA提取率和純度的關(guān)鍵所在，同時(shí)對(duì)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)生抑制作用。因此本試驗(yàn)采用提取率及純化率較高的試劑盒法，有效的提高了桉樹組培苗及輕基質(zhì)中青枯菌的檢測(cè)靈敏度。但是此方法是否能成功的檢測(cè)出自然發(fā)病組織中或自然狀態(tài)下存活于輕基質(zhì)中的青枯菌，還有待后續(xù)工作中的進(jìn)一步研究。

利用Seal等設(shè)計(jì)的以16S RNA為靶基因的青枯菌特異性引物序列OLI1/Y2，通過人工接種青枯菌的方法，成功檢測(cè)出桉樹組培苗組織中102CFU/mL及輕基質(zhì)中103CFU/mL的青枯菌。此方法能在12 h內(nèi)完成樣品的快速檢測(cè)，并且具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

為生產(chǎn)實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速檢測(cè)提供了理論技術(shù)的支持。

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Rapid detection of Ralstonia solanacearum in substrates and tissue culture seedlings of Eucalyptus by polymerase chain reaction method

WANG Yan1, WU Zhi-hua1, LI Guo-qing1, XIE Yao-jian1, ZHOU Xu-dong1,2
(1. China Eucalypt Research Centre , Zhanjiang 524022 , Guangdong, China; 2. Futuragene Biotechnology Co. Ltd., Shanghai 200235,China)

Bacterial wilt is rapid onset and not easy to control, and is a kind of soilborne pathogen caused by Ralstonia solanacearum.In order to realize rapid detection of the pathogens from tissue culture seedling and substrates as early as possible in latent infection,a pair of primers OLI1/Y2 was used by amplify 16S rRNA sequence to rapidly detect the pathogens and the numbers in Ralstonia solanacearum. Then, genomic DNA was extracted by using kit. The results show that the purity values of DNA A260/A280were in the 1.7～1.9; the detection limits of Eucalyptus tissue culture organization and substrates were 102CFU/mL and 103CFU/mL respectively.Therefore, the fast-detection method can provide a new way to prevent and control dissemination of bacterial wilt.

eucalyptus bacterial wilt; detection sensitivity；tissue culture seedling; light media ; polymerase chain reaction method

S792.38；S763.05

A

1673-923X(2013)09-0042-04

2012-10-16

拮抗青枯病菌菌株的篩選及應(yīng)用技術(shù)（2012BAD19B08）；桉樹重大病蟲害控制技術(shù)研究與示范（2010kjcx015-03）

王 艷（1986-），女，碩士研究生，主要研究方向：森林病害

周旭東（1973-），男，研究員，碩士生導(dǎo)師；E-mail：david@futuragene.com

[本文編校：吳 毅]