尹 敬，田 煒，魏建強(qiáng)，喇孝瑾，楊雨旸，李繼安*

1河北聯(lián)合大學(xué) 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)國(guó)際合作基地;2 唐山工人醫(yī)院，唐山 063000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，隨著糖尿病患病率逐年增加及病程的延續(xù)，糖尿病心肌病的發(fā)病率也迅速上升。糖尿病心肌病主要以心功能降低，心肌肥大為主要表現(xiàn)，長(zhǎng)期發(fā)展還可以導(dǎo)致心肌纖維化和心力衰竭。雖然其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但是高血糖及其高血糖通過(guò)活性氧簇誘導(dǎo)氧化應(yīng)激在DCM 發(fā)病機(jī)制中的作用一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)［1］。在高糖及氧化應(yīng)激引起的心肌損害中，線粒體功能障礙是其主要表現(xiàn)形式［2］。因此，通過(guò)心肌線粒體功能評(píng)價(jià)來(lái)篩選心肌保護(hù)中藥是當(dāng)今的重要研究途徑。我們以高糖培養(yǎng)建立H9c2 心肌細(xì)胞損傷模型，以臨床經(jīng)驗(yàn)方通平養(yǎng)心方作為對(duì)模型細(xì)胞干預(yù)因素，觀察其對(duì)高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

通平養(yǎng)心方(由瓜蔞、紅景天、葛根、黃芪、丹參、桂枝、薤白、麥冬、赤芍、甘草、蘇子、萊菔子組成):所有中藥飲片均購(gòu)于唐山市北京同仁堂藥店，由河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥物制備。

制備方法:將上述藥物按組方比例混合，研粗末裝于4 層紗布袋封口并置于燒杯中，加10 倍量水浸泡1 h，用文火煎煮2 h，過(guò)濾藥液;藥渣再加8 倍量水煮沸1 h，過(guò)濾藥液，將2 次濾液合并，濃縮成濃度為1 g/mL 的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細(xì)胞株

大鼠胚胎心臟組織來(lái)源的H9c2 細(xì)胞株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 主要材料與試劑

MTT 細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司(批號(hào):NXM0765)。抗體p-JNK、GAPDH、SP600125 等均購(gòu)自Cell Signaling technology Inc(CST)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號(hào):A0208);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(批號(hào):A0216);BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.4 儀器

37 ℃二氧化碳孵箱(美國(guó)ThermoForma 公司)，F(xiàn)V1000 激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，生物安全柜(海爾集團(tuán)有限公司)，5804R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf 公司)，JY200C 電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀以及半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(均來(lái)自BIO-RAD 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2 細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下，以10%FBS 低糖(5.5 mmol/L)DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)進(jìn)行傳代，并取4～6 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)血清低糖DMEM 培養(yǎng)細(xì)胞48 h，使各組細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 激光共聚焦檢測(cè)線粒體膜電位的變化

于超凈臺(tái)內(nèi)，將生長(zhǎng)到80%～90%融合狀態(tài)的細(xì)胞用胰酶消化下來(lái)并離心，棄上清后用培養(yǎng)基重懸，混勻，每個(gè)共聚焦小皿中加入2 mL 細(xì)胞懸液，標(biāo)記后置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度孵箱培養(yǎng)48 h后;棄去小皿中的培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 遍，每個(gè)小皿加入新培養(yǎng)基2 mL，并加入線粒體膜電位的特異性標(biāo)記物TMRE(100 nM)2 μL，37 ℃孵箱孵育20 min后將小皿置于共聚焦顯微鏡觀測(cè)臺(tái)，隨機(jī)選取視野觀察，用波長(zhǎng)為543 nm 氦氖激光激發(fā)TMRE 熒光染料產(chǎn)生紅色熒光。

實(shí)驗(yàn)分組及處理方法:①Control 組，即高糖組(High Glucose，HG)，小皿置于共聚焦顯微鏡觀測(cè)臺(tái)后選定視野并掃描圖像，隨后加入33 mmol/L 高糖培養(yǎng)基［3，4］，觀察時(shí)間為20 min，掃描圖像。②通平養(yǎng)心方處理組(TP):在小皿進(jìn)行換培養(yǎng)液后將小皿置于共聚焦顯微鏡觀測(cè)臺(tái)后選定視野并掃描圖像，然后加入不同終濃度的(10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL)通平養(yǎng)心方進(jìn)行圖像掃描，于10 min 后對(duì)同視野進(jìn)行圖像掃描，隨后加入高糖培養(yǎng)基觀察時(shí)間為20 min，掃描圖像。③SP600125 處理組(SP):小皿換液后選定視野并掃圖，加入10 μM 的JNK 抑制劑SP600125 后進(jìn)行圖像掃描，于10 min 后對(duì)同視野進(jìn)行圖像掃描，隨后加入高糖培養(yǎng)基觀察時(shí)間為20 min，掃描圖像。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使得96 孔板每孔加入100 μL 約2000個(gè)細(xì)胞。按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48 h 后，每孔重新?lián)Q培養(yǎng)基100 μL 后加入10 μL MTT 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。隨后每孔再加入150 μL DMSO，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育15 min 左右，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫色結(jié)晶物全部溶解后，酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

實(shí)驗(yàn)分組:①Control 組，低糖(5.5mmol/L)組;②HG 組，高糖(33mmol/L)組;③TP +HG 組，通平養(yǎng)心方(0.1 μg/mL)預(yù)處理10 min，再加入高糖培養(yǎng)基20 min;④TP 組，通平養(yǎng)心方(0.1 μg/mL)預(yù)處理10 min，再加入低糖培養(yǎng)基20 min。

1.2.4 Western Blot 檢測(cè)p-JNK、p-GSK-3β 水平

收集各組細(xì)胞，加入裂解液于冰上裂解30 min，刮取細(xì)胞，4 ℃、12000 rpm 離心15 min。將上清移至1 mL Ep 管中。用BCA 蛋白定量試劑盒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm 波長(zhǎng)下蛋白的吸光度。制備10%分離膠和5%濃縮膠，將蛋白與2 ×上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min 使蛋白變性。上樣總蛋白為60 μg，加入電泳緩沖液，80 V 電泳約40 min，待進(jìn)入分離膠后改為150 V 約1 h。再以52 mA，轉(zhuǎn)PVDF 膜2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入相應(yīng)一抗(p-JNK 1 ∶1000，p-GSK-3β 1 ∶1000，GAPDH 1∶500)，4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min。加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1000)，山羊抗小鼠IgG(1∶1000)，室溫孵育2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL 顯色，暗室內(nèi)曝光。結(jié)果用ImageJ 軟件分析，計(jì)算條帶的吸光度值，采用目的蛋白與內(nèi)參的比值來(lái)表示蛋白表達(dá)水平。

實(shí)驗(yàn)分組:①Control 組，加入低糖(5.5 mmol/L)培養(yǎng)基20 min;②HG 組，加入高糖(33 mmol/L)培養(yǎng)基20 min;③TP +HG 組，通平養(yǎng)心方預(yù)(0.1 μg/mL)處理10 min，再加入高糖培養(yǎng)基20 min;④TP組，通平養(yǎng)心方預(yù)(0.1 μg/mL)處理10 min，再加入低糖培養(yǎng)基20 min;⑤SP 組，JNK 抑制劑預(yù)處理組10 min，再加入低糖培養(yǎng)基20 min;⑥SP+HG 組，JNK 抑制劑預(yù)處理10 min，再加入高糖培養(yǎng)基20 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以Excel 表建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)、方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同處理組細(xì)胞TMRE 熒光強(qiáng)度的影響

33mmol/L 葡萄糖(HG)處理H9c2 細(xì)胞20 min后，TMRE 熒光強(qiáng)度明顯減弱(降至45.1 ±2.8 %，P＜0.05)，提示此濃度的葡萄糖可以引起線粒體損傷，從而引起mPTP 的開放。與高糖組相比，用JNK抑制劑SP600125(10μM)及不同濃度(10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL)通平養(yǎng)心方預(yù)處理，各組均使高糖引起的TMRE 熒光減弱程度下降(P＜0.05)，其中0.1 μg/mL TP 組的抑制作用最為顯著(90.1± 3.7%，P＜0.05)，與JNK 抑制劑作用類似，提示TP 可以抑制高糖引起的線粒體損傷，并且這種保護(hù)作用以0.1 μg/mL 組最為顯著(表1，圖1)。

表1 不同處理組TMRE 熒光強(qiáng)度變化(n=7，)Table 1 TMRE fluorescence intensities in different treatment groups(n=7，)

表1 不同處理組TMRE 熒光強(qiáng)度變化(n=7，)Table 1 TMRE fluorescence intensities in different treatment groups(n=7，)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05.

2.2 通平養(yǎng)心方降低高糖引起的心肌細(xì)胞毒性

與Control 組(低糖5.5 mmol/L)相比，0.1 μg/mL TP 預(yù)處理能顯著對(duì)抗HG 對(duì)H9c2 心肌細(xì)胞的毒性作用，使細(xì)胞存活率從73.0 ±2.0%增加至89.3 ±3.5%(P＜0.05;表2)。

表2 不同處理組對(duì)細(xì)胞活性的影響(n=20，)Table 2 Effects of different treatment groups on cell viability(n=20，)

表2 不同處理組對(duì)細(xì)胞活性的影響(n=20，)Table 2 Effects of different treatment groups on cell viability(n=20，)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05，#P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05，#P＜0.05.

圖1 激光共聚焦顯微鏡成像顯示不同處理組TMRE 熒光強(qiáng)度(×400)Fig.1 TMRE fluorescence intensities in different treatment groups detected by LSCM(×400)

2.3 通平養(yǎng)心方對(duì)JNK 通路的影響

Western blot 結(jié)果顯示(表3，圖2)，與Control組(低糖5.5 mmol/L)相比，HG 能夠引起p-JNK 的表達(dá)明顯增高(198.6 ±22.0%，P＜0.05)，0.1 μg/mL TP 預(yù)處理后使高糖引起的p-JNK 的表達(dá)增高被抑制(113.5 ±7.9%，P＜0.05)。在加入JNK 抑制劑SP600125 預(yù)處理后，同樣使得高糖引起的p-JNK的表達(dá)增高被抑制(129.7 ±7.8%，P＜0.05)，說(shuō)明通平養(yǎng)心方與JNK 抑制劑SP600125 的作用相似，提示通平養(yǎng)心方可通過(guò)下調(diào)p-JNK 的表達(dá)發(fā)揮抗心肌氧化損傷作用。

2.4 通平養(yǎng)心方對(duì)GSK-3β 磷酸化的影響

Western blot 結(jié)果顯示(表4，圖3)，與對(duì)照組相比，高糖能夠引起p-GSK-3β(Ser9)表達(dá)明顯降低，提示高糖引起的氧化應(yīng)激通過(guò)抑制GSK-3β 磷酸化，促進(jìn)mPTP 孔的開放。單獨(dú)通平養(yǎng)心方處理組與HG 組相比，p-GSK-3β 的表達(dá)增高(130.9 ±7.3%，P＜0.05)，提示通平養(yǎng)心方可以促進(jìn)GSK-3β 磷酸化。與HG 組相比，0.1 μg/mL TP +HG 處理組p-GSK-3β 表達(dá)增加(89.9 ±10.9%，P＜0.05)，而這種增加作用，與JNK 抑制劑SP600125 類似，說(shuō)明在高糖引起的心肌損傷時(shí)，通平養(yǎng)心方可能是通過(guò)降低JNK 的活性，使p-GSK-3β 表達(dá)增加，抑制mPTP的開放，從而對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

表3 p-JNK 蛋白的表達(dá)(n=6，)Table 3 The optical density of the expression of p-JNK(n=6，)

表3 p-JNK 蛋白的表達(dá)(n=6，)Table 3 The optical density of the expression of p-JNK(n=6，)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05;與高糖(HG 組)比較，#P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05;Compare with high glucose，#P＜0.05.

圖2 p-JNK 蛋白的表達(dá)Fig.2 The optical density of the expression of p-JNK

表4 p-GSK-3β 蛋白的表達(dá)(n=6，)Table 4 The optical density of the expression of p-GSK-3β(n=6，)

表4 p-GSK-3β 蛋白的表達(dá)(n=6，)Table 4 The optical density of the expression of p-GSK-3β(n=6，)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05;與高糖(HG 組)比較，#P＜0.05;與高糖+通平組相比，△P＜0.05。Note:Compare with control，* P＜0.05;Compare with high glucose，#P＜0.05;Compare with high glucose and TP，△P＜0.05.

圖3 p-Gsk-3β 蛋白的表達(dá)Fig.3 The optical density of the expression of p-Gsk-3β

3 討論

糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中高血糖作為心肌損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素能造成心肌氧化代謝異常［5］，持續(xù)的高糖狀態(tài)使心肌細(xì)胞處于過(guò)度氧化應(yīng)激狀態(tài)，而過(guò)度的氧化應(yīng)激可激活多條促凋亡信號(hào)通路［6］。其中JNK 通路可能參與了高糖誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞的凋亡過(guò)程。GSK-3β 作為JNK 通路下游因子，是調(diào)控心肌細(xì)胞mPTP 開放的關(guān)鍵，而mPTP對(duì)維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，應(yīng)激條件下mPTP 開放會(huì)導(dǎo)致線粒體腫脹，膜電位消失，這是引起心肌損傷的重要環(huán)節(jié)［7］。許多心肌保護(hù)藥物是通過(guò)抑制GSK-3β 的活性來(lái)阻止mPTP 開放，從而在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用的［8，9］。因此，JNK 通路可能也是高糖所致心肌損害的重要途徑，由此推測(cè)，JNK 通路可能是治療糖尿病心肌病的新靶點(diǎn)。

通過(guò)參考Cai 等［3］和Li 等［4］的相關(guān)研究，本研究主要采用33 mmol/L 作為高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在33 mmol/L 高糖處理?xiàng)l件下，H9c2 細(xì)胞TMRE 熒光強(qiáng)度明顯減弱，細(xì)胞存活率明顯降低，p-JNK 蛋白表達(dá)增加，GSK-3β 磷酸化水平顯著降低。而這一作用被JNK 的抑制劑SP600125拮抗，進(jìn)一步證明JNK 通路參與了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷(表3，圖2)。由此提示，高濃度的葡萄糖對(duì)心肌細(xì)胞的損害是通過(guò)JNK-GSK-3β-mPTP 途徑實(shí)現(xiàn)的。

通平養(yǎng)心方由《金匱要略》瓜蔞薤白白酒湯合三子養(yǎng)親湯化裁而來(lái)，全方合用通陽(yáng)散結(jié)，祛痰下氣，活血通脈。臨床觀察對(duì)糖尿病心肌病有良好治療作用。方中主要藥物瓜蔞有保護(hù)缺血心肌，縮小梗死范圍的作用。另外，我們研究發(fā)現(xiàn)，方中其他主要藥物，如紅景天的主要成分紅景天苷可抑制心肌細(xì)胞mPTP 的開放發(fā)揮保護(hù)心肌作用［10］、葛根的主要成分葛根素對(duì)糖尿病大鼠心肌有保護(hù)作用［11］。由此推測(cè)通平養(yǎng)心方防治糖尿病心肌病作用的機(jī)制之一是通過(guò)心肌保護(hù)實(shí)現(xiàn)的。

研究結(jié)果提示，通平養(yǎng)心方預(yù)處理能保護(hù)高糖引起的心肌細(xì)胞損傷，抑制p-JNK 蛋白表達(dá)，提高GSK-3β 磷酸化水平，能夠抑制mPTP 開放，減輕高糖應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損傷(表1，圖1)，增加細(xì)胞存活率(表2)。其中0.1 μg/mL 濃度的通平養(yǎng)心方最佳，其與JNK 的抑制劑SP600125 作用相似。

綜上所述，通平養(yǎng)心方對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制之一可能是通過(guò)JNK 通路，抑制p-JNK 蛋白表達(dá)、促進(jìn)GSK-3β 的磷酸化、從而抑制mPTP 的開放實(shí)現(xiàn)的。

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