張亞平，曹小妮，路盼盼，余鵬，李建輝

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆泥火山群土壤真菌群落的DGGE分析

張亞平，曹小妮，路盼盼，余鵬，李建輝

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

采用DGGE指紋圖譜技術(shù)對(duì)新疆烏蘇的泥火山區(qū)的土壤真菌群落18SrDNA進(jìn)行電泳分離，通過(guò)Quantity one軟件對(duì)圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，并對(duì)主要條帶進(jìn)行回收測(cè)序。DGGE圖譜聚類(lèi)分析顯示，五月份表層土真菌的種類(lèi)和數(shù)量豐富。群落結(jié)構(gòu)在相同季節(jié)垂直分布上相似性較高，聚集到一個(gè)分支上；而不同季節(jié)土樣真菌組成差異較大。特異條帶的回收測(cè)序結(jié)果表明，泥火山真菌優(yōu)勢(shì)菌群為鏈格孢屬真菌和多枝橫梗霉屬。新疆泥火山土壤真菌的多樣性較高但數(shù)量偏少，受氣候環(huán)境因素的影響較大，優(yōu)勢(shì)菌群受此影響較小。

泥火山；18SrDNA；DGGE

泥火山是以噴發(fā)泥漿水為主的火山，由于其噴發(fā)口內(nèi)溫度恒定且較低，又稱(chēng)涼火山。泥火山是在特定地質(zhì)條件下形成的罕見(jiàn)自然地質(zhì)景觀，是地層內(nèi)部圈閉氣體由于壓力釋放上沖的結(jié)果[1]。目前，中國(guó)最大的泥火山群分布在新疆烏蘇一帶，形成新疆烏蘇泥火山群。而且含有豐富的煤礦和油藏，這種特殊環(huán)境中微生物產(chǎn)生一系列適應(yīng)油氣、低溫、鹽堿、寡營(yíng)養(yǎng)、冷暖交替等極端因子的分子多態(tài)性，這些特殊多樣的微生物資源，具有發(fā)展生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的資源優(yōu)勢(shì)[2-5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越重視泥火山研究[6]。

變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)，是近幾年發(fā)展起來(lái)的廣泛用于研究微生物多樣性的分子生物技術(shù)[7]。能快速有效地分析某一特定環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)，了解其種群動(dòng)態(tài)，是研究土壤微生物群落的有效手段[8-12]。本文以新疆烏蘇泥火山群為研究對(duì)象，首次利用DGGE技術(shù)分析泥火山土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集

分別于2010年5月、8月、10月赴新疆烏蘇泥火山群采集土壤樣品。在采樣地根據(jù)樣地的地形和土壤類(lèi)型，選取之字形多點(diǎn)采樣方法采集土壤樣品。采樣之前，先用該處土壤反復(fù)擦拭鐵鏟，每樣點(diǎn)取5個(gè)層次的土壤，取樣深度依次為0～10 cm，10～20 cm，20～30 cm，30～40 cm，40～50 cm。

1.2 真菌總DNA的提取純化

主要方法步驟參照文獻(xiàn)[13]：①稱(chēng)取充分研磨5 g土樣，加入13.5 mL DNA提取液（100 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1Na3PO4，1.5 mol·L-1NaCl，1%CTAB，pH 8.0）和20顆直徑為3 mm左右的玻璃珠，充分震蕩3 min。②加入500 μL溶菌酶（50 mg·mL-1），震蕩30 s，37℃水浴30 min：之后加入纖維素酶和蝸牛酶，37℃水浴30 min[14]；加入20 μL蛋白酶K（20 mg·mL-1），震蕩30 s，37℃水浴30 min。③加入1.5 mL 10%SDS后，-20℃放置1 h，65℃水浴1 h（每隔15 min上下顛倒晃動(dòng)幾次），重復(fù)此操作2次。④6 000 g離心10 min；取上清液，用等體積苯酚和氯仿∶異戊醇（24∶1）各抽提2次，12 000 g離心15 min，取上清。⑤加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置2 h或過(guò)夜，12 000×g離心15 min，棄上清。⑥沉淀加5 mL預(yù)冷70%乙醇，12 000 g離心20 min，收集DNA沉淀，風(fēng)干，適量雙蒸水溶解。

1.3 基因組DNA 18SrDNA的片段擴(kuò)增

采用天根生化科技（北京）有限公司提供的凝膠回收試劑盒，對(duì)提取得到的基因組DNA進(jìn)行回收純化。采用巢氏PCR的方法對(duì)其擴(kuò)增。引物的選取參照文獻(xiàn)[15]。

選取真菌通用引物EF4f/Fung5r擴(kuò)增，反應(yīng)體系（20 μL）：10×buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，TaqDNA（5 U·μL-1）0.6 μL，模板1 μL，ddH2O 11.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s；54℃30 s；72℃2 min；35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。

二套擴(kuò)增引物為EF4/R518GC，反應(yīng)體系（25 μL）：10×buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，TaqDNA（5 U·μL-1）0.6 μL，模板2 μL，ddH2O 13.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s；54℃30 s；72℃2 min；40個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。

1.4 DGGE分析

采用Bio-Rad電泳系統(tǒng)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。制備8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度為40%～60%，樣品加樣量為15 μL，電泳條件為60℃，130 V，1×TAE電泳6 h，電泳膠的染色方法參照Bassam的銀染方法[16]，DGGE條帶采用Quantity One軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 18SrDNA片段PCR擴(kuò)增

選取部分土壤總DNA分別以EF4、Fung5r和R518GC、EF4為引物做巢式PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為534 bp，400 bp；以1%瓊脂糖檢測(cè)電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 一擴(kuò)二擴(kuò)的PCR產(chǎn)物Fig.1 Profile of the first round and the second round PCR products

2.2 DGGE圖譜多樣性分析

以R518GC和EF4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析，分別得到不同土壤樣品的DGGE圖譜（見(jiàn)圖2）。DGGE圖譜中條帶的數(shù)目代表不同月份不同土層真菌的豐富度，條帶的信號(hào)強(qiáng)度代表真菌種屬的數(shù)量，因此該DGGE圖譜可以用來(lái)反映泥火山土壤真菌的多樣性差異。圖2中，每個(gè)土壤樣品都有其特異性的條帶,把不同月份的條帶進(jìn)行相互比較可以得出：五月份土樣中0～10 cm土層豐富度最高，八月份10～20 cm土層豐富度最高，十月份30～40 cm土層豐富度最高，不同月份的土樣表現(xiàn)出極大的相似性。由此可以推出隨著時(shí)間的推移，泥火山土壤真菌由表層土壤向深處遷移的趨勢(shì)。

2.3 樣品相似性分析

圖2用Quantity One軟件（Bio-Rad）對(duì)其做DG?GE圖譜分析，并繪制系統(tǒng)樹(shù)，該系統(tǒng)根據(jù)戴斯系數(shù)CS（Dice coefficient）按照有關(guān)方法（UPGMA算法）計(jì)算繪出（見(jiàn)圖3）。CS=2j/（a+b），j是樣品A和B共有條帶，a和b分別是樣品A和B中各自的條帶數(shù)。戴斯系數(shù)的范圍是從0（無(wú)共同帶）到1（所有的條帶相同），由戴斯系數(shù)可得相似性矩陣（見(jiàn)表1）。

圖2 PCR產(chǎn)物的DGGE電泳圖譜Fig.2 DGGE profiles of the PCR products

表1 DGGE圖譜的相似性分析Table 1 Similarity Analysis of DGGE patterns

從表1可知，1、2、3泳道的相似性約為70%，而與4和5泳道的相似性約為30%，可見(jiàn)五月份的淺層土壤真菌組成相對(duì)于深層土壤變化較小，群落結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。結(jié)合聚類(lèi)分析圖3可知，泳道1、2、3、4相對(duì)于其他泳道分支相似性較高。把聚類(lèi)分析圖與相似性矩陣相結(jié)合，得出不同月份的不同土層真菌組成差異性較大；而不同月份同一土層相似性比較，5月份與10月的表層土相似性系數(shù)為62.4%，而與8月份的表層土相似性系數(shù)只有21.2%；3個(gè)不同月份深層土壤40～50 cm土層群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，變化不明顯，群落結(jié)構(gòu)受氣候環(huán)境因素的影響較大，受地溫影響較小。

2.4 克隆子序列的Blast分析

DGGE圖譜中廣泛分布的條帶，標(biāo)記為A、 B、C，對(duì)其進(jìn)行條帶回收及克隆測(cè)序，BLAST比對(duì)結(jié)果如表2。

由表2可知，序列同源性達(dá)到97%以上時(shí)可確定為同一種，同源性達(dá)到95%以上可把這些菌歸為同一屬[17]。比對(duì)結(jié)果表明是鏈格孢屬和多枝橫梗霉屬，為泥火山土壤中的優(yōu)勢(shì)種群。

圖3 DGGE圖譜聚類(lèi)分析Fig.3 Dendrogram showing the relatedness of the DGGE banding patterns

表2 測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 2 Sequence alignment with blast

3 討論

DGGE是一種能夠快速有效地檢測(cè)土壤微生物群落多樣性及動(dòng)態(tài)變化的分子生物學(xué)技術(shù)。本文利用該技術(shù)對(duì)新疆烏蘇泥火山不同月份和不同深度土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及變化進(jìn)行研究。

通過(guò)對(duì)新疆泥火山真菌的DGGE圖譜分析，結(jié)果表明泥火山真菌多樣性較高但數(shù)量偏少，相同季節(jié)不同深度真菌多樣性相似，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；其優(yōu)勢(shì)菌群為鏈格孢屬和多枝橫梗霉屬。較豐富的真菌在3個(gè)季節(jié)的不同土層都有所分布，隨季節(jié)變化會(huì)產(chǎn)生一定遷移現(xiàn)象：由表層土壤向至深層土壤遷移。說(shuō)明環(huán)境氣候，生態(tài)環(huán)境等因素對(duì)泥火山真菌群落分布影響較大，但優(yōu)勢(shì)菌群受其影響較小。

可培養(yǎng)方法和DGGE電泳技術(shù)相結(jié)合分析表明泥火山真菌優(yōu)勢(shì)菌群為鏈格孢屬和多枝橫梗霉屬。而新疆泥火山氣候干旱，常年高溫，土壤貧瘠，高鹽堿，各種礦物元素含量偏低，這種條件能夠滿足低等真菌的繁殖。結(jié)合泥火山的極端環(huán)境及菌屬特征分析：鏈格孢屬為半知菌門(mén)和橫梗霉屬真菌為接合菌亞門(mén)毛霉屬，是土壤常見(jiàn)菌屬。其中毛霉屬菌喜高溫高濕環(huán)境，多為工業(yè)發(fā)酵菌[18]，其功能特性有待深入研究。

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Analysis of the fungi communities in mud volcano soils in Xinjiang using DGGE

ZHANG Yaping,CAO Xiaoni,LU Panpan,YU Peng,LI Jianhui
(School of Life Science,Shihezi University,Shihezi Xinjiang 832003,China)

Reveal the bacterial community structure and dynamics in mud volcano soil in Xinjiang.18S-rDNA-ragmentDGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)andclonesequenceBLAST technologies were applied,quantity one software was used to map the dendrogram.The cluster analysis of DGGE profiles showed that the number of species of fungi were the most abundant in the surface soil of May and community structure during the same season of the vertical distribution of high similarity,clustered into a branch;and fungi in soil samples composed of different seasons were quite different.The recovery of specific bands sequencing result showed that mud volcano fungi as Alternaria dominantfungi wereAlternaria tenuissima.sp andLichtheimia ramosa.sp.The fungi polymorphism in mud volcano soil in Xinjiang was significant,but the quantity was few,and this diversity was vulnerable to ecological,climatic and other factors.But the dominant microorganisms affected less.

Mud volcano;18SrDNA;DGGE

Q938.1

A

1005-9369（2014）04-0066-05

2014-03-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（30860001）

張亞平（1964-），女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail:xhsl-001@163.com。

時(shí)間2014-4-21 13:26:37[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1326.042.html

張亞平,曹小妮,路盼盼,等.新疆泥火山群土壤真菌群落的DGGE分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(4)∶66-70.

Zhang yaping,Cao Xiaoni,Lu Panpan,et al.Analysis of the fungi communities in mud volcano soils in Xinjiang using DGGE [J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶66-70.(in Chinese with English abstract)