蔣新龍 蔣益花 蔡成崗 李文夏

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

應(yīng)用安全無(wú)毒的天然食用色素代替合成食用色素是大勢(shì)所趨?；ㄉ帐且活惥咭欢I(yíng)養(yǎng)和藥理作用的高附加值的天然色素[1-2]。花色苷是2-苯基-苯并吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)的衍生物，因其苯并吡喃環(huán)上缺電子，具有高度活性[3]，而限制了其使用范圍?；ㄉ盏姆€(wěn)定性受到溫度、光、pH、O2、輔助色素及本身濃度等因素的影響[4]。一般高溫、見光、高pH易使花色苷降解[5]。花色苷的降解不僅影響了色澤，而且會(huì)產(chǎn)生對(duì)食品安全帶來(lái)危害的有害物質(zhì)[6]。因此，提高花色苷的穩(wěn)定性已成為研究熱點(diǎn)。目前提高花色苷穩(wěn)定化技術(shù)主要有分離精制技術(shù)、添加輔色劑、結(jié)構(gòu)改性、微膠囊化技術(shù)等[7]。筆者團(tuán)隊(duì)前期選用其他學(xué)者研究較少但較常見且安全無(wú)毒價(jià)格便宜的草酸、檸檬酸、丁二酸、丙二酸、乙酸等有機(jī)酸為輔色劑，以富含花色苷的黑豆種皮為原料，對(duì)其花色苷進(jìn)行輔色效應(yīng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)草酸的輔色效果最好。本試驗(yàn)主要以黑豆種皮花色苷為研究對(duì)象，進(jìn)行草酸輔色花色苷的制備及其光熱降解動(dòng)力學(xué)研究，為黑豆種皮花色苷的進(jìn)一步綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：供試黑豆品種為“黑豆1號(hào)”，種皮由安徽黑糧農(nóng)業(yè)種植推廣專業(yè)合作社提供。取其種皮，烘干，過(guò)60目篩，備用。

儀器：UV-2450PC紫外可見分光光度計(jì)：島津；UV-9100紫外可見光譜儀：北京瑞利；AL204電子分析天平：上海壘固儀器有限公司；pHS-3B型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海喬躍電子有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

大孔吸附樹脂AB-8(凈品級(jí))：天津海光化工有限公司。所用試劑為分析純，所用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花色苷母液的制備

根據(jù)李莉蓉等[8]制備方法并稍做改動(dòng)：稱取黑豆種皮1 000 g用60%乙醇液按1∶4的料液比，用1 mo1/L鹽酸調(diào)至pH 3，避光下浸提2 d。濾紙過(guò)濾，收集濾液，于50 ℃下減壓濃縮，濃縮液用等體積的石油醚萃取3次后過(guò)AB-8大孔樹脂，再用70%酸性乙醇液洗脫，將所得洗脫液于50 ℃下減壓濃縮，得花色苷母液。真空干燥后得黑大豆花色苷(black soybean anthocyanin，簡(jiǎn)稱BSA，下同)，呈粉末狀，深黑色。

1.2.2 花色苷濃度定量方法

根據(jù)朗伯比爾定律，溶液的吸光值A(chǔ)與其濃度C成正比，故該實(shí)驗(yàn)以吸光度作為花色苷濃度指標(biāo)。

1.2.3 輔色花色苷制備及效果評(píng)價(jià)

草酸對(duì)黑大豆花色苷的輔色屬于分子間輔色。輔色劑草酸與花色苷分子以氫鍵和非共價(jià)結(jié)合可形成“花色苷-輔色劑”復(fù)合物。輔色劑與花色苷的輔色反應(yīng)方程式[4]：AH++L ≒ AHL+

式中：L為輔色劑，AHL+為“花色苷-輔色劑”復(fù)合物。

花色苷在水溶液中存在的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子、醌型堿、假堿、查耳酮的4種形式隨溶液的pH變化而相互轉(zhuǎn)化。在pH大于2的酸性介質(zhì)中，花色苷開始由2-苯基-苯并吡喃陽(yáng)離子水解為無(wú)色醇型假堿[9]。從輔色劑與花色苷的反應(yīng)方程式可知，當(dāng)AH+含量較少時(shí)，輔色劑L對(duì)輔色作用貢獻(xiàn)度較大。Bobbio[10]研究也表明，在2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子含量低時(shí)，輔色劑對(duì)花色苷的輔色作用較有效。輔助成色作用的關(guān)鍵在于pH，在較高pH條件下輔色劑更有利于花色苷烊陽(yáng)離子的方向進(jìn)行[11]。所以需要確定2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子與無(wú)色醇型假堿水解平衡常數(shù)進(jìn)行輔色試驗(yàn)?；ㄉ盏乃馄胶獬?shù)pKn是吸光值為最大吸光值1/2時(shí)的溶液pH值[4]。參考勵(lì)建榮等[4]試驗(yàn)方法來(lái)確定花色苷水解平衡點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：黑豆種皮花色苷水解平衡點(diǎn)約為pH 3.5。

吸取一定量pH 3.5的已純化花色苷濃縮液10份，加入0.01 mol/L的草酸作為輔色劑，使溶液中草酸濃度為0.0、0.5、1.0、2.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mmol/L，測(cè)定450～580 nm范圍內(nèi)最大吸收峰(λmax)及最大吸光值(Amax)。輔色效果的評(píng)價(jià)以每摩爾每升草酸引起的花色苷吸光值增加量I表示[12]：

I=A-A0/C草酸

(1)

式中：C草酸為草酸濃度/mol/L；A為加入草酸后溶液的吸光值；A0為純花色苷溶液的吸光值。

1.2.4 熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定

將輔色前后花色苷先用極少量50%乙醇溶解，用pH 1.0、3.5、4.5的緩沖液配制色素液稀釋至適當(dāng)濃度(A=0.45～0.80)用作熱光降解試驗(yàn)[13]。

將降解用花色苷溶液分別置于50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴中10 h，每隔2 h測(cè)定吸光度值。重復(fù)3次。許多學(xué)者研究表明，輔色反應(yīng)符合一級(jí)反應(yīng)[12，14]。假設(shè)草酸對(duì)黑豆種皮花色苷進(jìn)行輔色處理的反應(yīng)也符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，則可根據(jù)下式計(jì)算熱降解反應(yīng)速率常數(shù)(k)、熱降解活化能(E0)、熱降解半衰期(t1/2)、溫度系數(shù)(Q10)等參數(shù)。

k、E0由Arrhenius方程確定[3，12]：

ln(c/c0)=-kt

(2)

lnk=lnk0-E0/RT

(3)

式中：c0為色素加熱前的最初濃度/mol/L；c為色素加熱后的終濃度/mol/L；t為反應(yīng)時(shí)間/h；k0為頻率常數(shù)；E0為活化能/kJ/mol；T為絕對(duì)溫度/K；R為氣體常數(shù)[8.314×10-3kJ/(mol·K)]。

根據(jù)朗伯比爾定律，溶液的吸光值A(chǔ)與其濃度c成正比，故(2)式可表示為ln (A/A0)=-kt。熱降解半衰期t1/2=0.693/k，熱降解率P：

P=(1-A/A0)×100%

(4)

Q10為溫度系數(shù)，k1、k2分別為溫度t1、t2℃時(shí)的速率常數(shù)。Q10值越大，表示熱降解反應(yīng)速率對(duì)溫度變化越敏感[15]。

Q10=(k2/k1)10/(t2-t1)

(5)

1.2.5 光降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定

將降解用花色苷溶液分別置于24 ℃恒溫室內(nèi)自然光(平均光強(qiáng)4 000 lx)、強(qiáng)日光(平均光強(qiáng)85 000 lx)和避光條件下進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，每隔2 d測(cè)吸光度值。重復(fù)3次。計(jì)算k和t1/2，方法同1.2.4。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)表示。數(shù)據(jù)分析采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，均值的多重比較采用Bonferronj法，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔色效果的評(píng)價(jià)

根據(jù)1.2.3方法，試驗(yàn)結(jié)果如表1。由表1可知，添加草酸后，花色苷的吸光度增大，且隨草酸濃度增大，溶液最大吸光值逐漸增大，說(shuō)明有輔色作用[11，16]。最大吸收波長(zhǎng)基本不變，沒有明顯的紅移效應(yīng)，這與許多學(xué)者研究結(jié)果不同[11-12]，但與楊振東[17]研究結(jié)果相似。從每摩爾每升草酸吸光值增加量看，草酸濃度為5.0 mmol/L時(shí)，I值最大，輔色效應(yīng)最高。此時(shí)黑豆種皮花色苷原始吸光度A為0.655，與草酸物質(zhì)的量之比為131。

表1 草酸對(duì)花色苷輔色作用/mmol/L

2.2 花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

已有大量研究表明，花色苷對(duì)光、熱表現(xiàn)出不穩(wěn)定的特性[18]。根據(jù)1.2.4方法，圖1為輔色前后不同pH的花色苷色素液熱穩(wěn)定性A～t的對(duì)應(yīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。再根據(jù)-ln(A/A。)-t作圖并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。結(jié)果表明線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R>0.95)，輔色前后花色苷熱降解均符合動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)規(guī)律，與許多學(xué)者研究結(jié)果相符[19-20]。

注：圖中每條曲線對(duì)應(yīng)的溫度自上而下依次為50、60、70、80、90 ℃。

注：y為-ln (A/A0)；x為t。

表3顯示，輔色前后的花色苷的熱穩(wěn)定性不同。在一定溫度下，以活化能計(jì)，草酸輔色BSA>未輔色BSA，說(shuō)明輔色花色苷的熱穩(wěn)定性較好，有利于色素在熱處理?xiàng)l件下的應(yīng)用及保存。Dangles 等[11]認(rèn)為，富電子的輔色劑和帶正電荷的花色苷烊陽(yáng)離子通過(guò)氫鍵等分子間作用力，可形成輔色劑-花色苷電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物，該復(fù)合物的形成使得花色苷烊陽(yáng)離子光譜特性發(fā)生改變，其表現(xiàn)為增色效應(yīng)和最大吸收波長(zhǎng)的改變。其次，該復(fù)合物使平衡向更有利于花色苷烊陽(yáng)離子的方向進(jìn)行，增加了其穩(wěn)定性，同時(shí)也增加了紅色調(diào)花色苷的比例。輔助成色作用是改善富含花色苷食品顏色的一種十分有價(jià)值的、純天然的方法[21]。

表3還表明，在不同的pH 條件下，花色苷的熱穩(wěn)定性不同?？傮w來(lái)說(shuō)，在一定溫度下，以活化能計(jì)，pH 1.0>pH 3.5>pH 4.5，說(shuō)明低pH值條件下，花色苷的熱穩(wěn)定性較好。在低pH環(huán)境下，輔色前后的花色苷熱降解的半衰期變化不大；在較高pH環(huán)境下，輔色后的花色苷熱降解的半衰期大大延長(zhǎng)，輔色前后的花色苷熱降解的半衰期有顯著差異(P<0.05)。

表3 不同pH值條件下花色苷熱降解參數(shù)

究其原因，在低pH環(huán)境下所有的花色苷本身都能轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ侦汝?yáng)離子，而在較高pH條件下，轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ侦汝?yáng)離子的相對(duì)較少，輔色作用有利于向花色苷烊陽(yáng)離子的方向進(jìn)行。

輔色前后花色苷熱降解的溫度系數(shù)Q10呈現(xiàn)相似的規(guī)律。從溫度系數(shù)Q10還可看出，pH 1.0條件下，花色苷在70～80 ℃的Q10值明顯大于其他溫度范圍內(nèi)的Q10值，說(shuō)明當(dāng)熱處理溫度從70 ℃提高到80 ℃時(shí)，花色苷降解速率迅速加快，而80～90 ℃時(shí)，降解速率變化不敏感。所以在食品加工時(shí)，花色苷盡量低溫處理避開敏感區(qū)。pH 3.5和pH 4.5條件下，花色苷降解速率對(duì)溫度反應(yīng)最敏感的區(qū)域均發(fā)生在80～90 ℃范圍內(nèi)。

2.3 花色苷光降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖2顯示，輔色前后花色苷的光穩(wěn)定性不同。相同pH條件，輔色BSA-暗處>BSA-暗處>輔色BSA-自然光>BSA-自然光>輔色BSA-強(qiáng)光>BSA-強(qiáng)光，光照強(qiáng)度和光照時(shí)間對(duì)花色苷的穩(wěn)定性影響較大，光照強(qiáng)度越高，時(shí)間越長(zhǎng)，花色苷降解程度越高；不同pH條件，pH 1.0>pH 3.5>pH 4.5。輔色花色苷的光穩(wěn)定性優(yōu)于未輔色花色苷。這也與形成輔色劑-花色苷電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物有關(guān)[11]。

不同花色苷色素液光穩(wěn)定性根據(jù)-ln(A/A0)-t作圖并進(jìn)行線性回歸，表4表明線性關(guān)系良好(R>0.96)，花色苷光降解符合動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)規(guī)律，與許多學(xué)者研究結(jié)果相符[22]。表5顯示，相同pH的色素液，光照強(qiáng)度大的穩(wěn)定性差，表現(xiàn)為降解速率大、半衰期短；相同光照強(qiáng)度，pH值大的穩(wěn)定性差。草酸輔色花色苷的半衰期比對(duì)應(yīng)未輔色的都要長(zhǎng)，但差異并不顯著(P>0.05)。用草酸輔色處理后能提高花色苷光穩(wěn)定性，有利于色素在光處理?xiàng)l件下的應(yīng)用及保存。

花色苷的光降解與光照強(qiáng)度、光照持續(xù)時(shí)間等因素有關(guān)，其機(jī)制是基態(tài)的花色苷吸收光能后轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的花色苷，激發(fā)態(tài)的花色苷再發(fā)生水解等降解反應(yīng)[6]。因此該色素在處理和貯藏過(guò)程中，應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射，長(zhǎng)期保存應(yīng)避光。Attoe等[23]認(rèn)為，光誘導(dǎo)花色苷降解主要是存在分子態(tài)氧的原因，草酸輔色處理盡管能通過(guò)分子作用力形成輔色劑-花色苷電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物，但阻擋不了分子態(tài)氧的作用。因此，不管是否輔色處理，花色苷在食品中應(yīng)用時(shí)，都應(yīng)采用真空包裝以提高產(chǎn)品穩(wěn)定性。

表4 不同pH值條件下不同花色苷光降解動(dòng)力學(xué)

注：y為-ln (A/A0)；x為t。

注：圖中每條曲線對(duì)應(yīng)的光照條件由上到下依次為避光、自然光和強(qiáng)光。

種類光照條件pH1．0pH3．5pH4．5k/d-1t1/2/dk/d-1t1/2/dk/d-1t1/2/dBSA強(qiáng)日光0．07699．0070．11925．8150．14544．766自然光0．010764．740．025027．750．041816．59避光0．0051136．90．009870．660．019435．80輔色強(qiáng)日光0．07149．7000．09747．1130．11126．233BSA自然光0．008482．670．022031．550．032321．44避光0．0039176．00．007690．800．016043．30

3 結(jié)論

以草酸對(duì)黑豆種皮花色苷進(jìn)行輔色處理，添加草酸后，花色苷的吸光度明顯增大，說(shuō)明草酸對(duì)花色苷有輔色作用。黑豆種皮花色苷原始吸光度與草酸物質(zhì)的量濃度之比為131時(shí)，輔色效果最佳。

草酸輔色黑豆種皮花色苷的光熱降解動(dòng)力學(xué)符合動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)規(guī)律，且線性關(guān)系良好(R>0.95)。在低pH環(huán)境下，輔色前后的花色苷熱降解的半衰期變化不大；在較高pH環(huán)境下，相對(duì)未輔色黑豆種皮花色苷，半衰期顯著延長(zhǎng)，熱降解活化能顯著增大，輔色效果較顯著(P<0.05)。草酸輔色處理有利于黑豆種皮花色苷在光熱處理?xiàng)l件下的應(yīng)用及保存。

黑大豆種皮中的花色苷主要是矢車菊-3-半乳糖苷[24]、飛燕草-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-葡萄糖苷和牽牛花-3-葡萄糖[25]，至于輔色前后的結(jié)構(gòu)變化及增強(qiáng)花色苷穩(wěn)定性的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究探索。

[1]Timberlake C F, Henry B S. Anthocyanins as natural food colorants[J]. Progress in Clinical and Biological Research，1988, 280: 107-121

[2]Tamura H，Yamagami A. Antioxidative activity of monoacylated anthocyanins isolated from muscat bailey a grape [J]. Food Chemistry, 1994, 42(8): 1612-1615

[3]斐尼馬．食品化學(xué)[M]．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1991：464-468

[4]勵(lì)建榮，岑沛霖，蔣志剛，等．單寧對(duì)楊梅汁花色苷穩(wěn)定性的影響[J]．科技通報(bào)，2001，17(6)：1-6

[5]Pericles M. Anthocyanins as food colors[M]．New York: Academic Press Inc, 1982. 10-21

[6]孫建霞，張燕，胡小松，等．花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與降解機(jī)制研究進(jìn)展[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(3)：996-1008

[7]何蘭，姜志宏．天然產(chǎn)物資源化學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社，2008：528-546

[8]李莉蓉，張名位，劉鄰渭，等．三種黑色糧油作物種皮花色苷提取物抗氧化能力的穩(wěn)定性比較[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(9):2045-2052

[9]Giris E F, Ferreira E A, Falcao L D, et a1. Caffeic acid copigmentation of anthocyanins from Cabernet Sauvignon grape extracts in model systems[J]．Food Chemistry, 2007, 100(3): 1289-1296

[10]Bobbio F O. Effect of light and tannic acid on the stability of anthocyanin in DMSO and in water[J]．Food Chemistry, 1994, 51(2): 183-185

[11]Dangles O, Brouillard R. Polypbenols interactions. The copigmentation case: thermodynamic data from temperature and relaxation kinetics. Medium effect[J]. Canadian Journal of Chemistry, 1992, 70: 2174-2189

[12]朱洪梅，韓永斌，顧振新，等．單寧對(duì)紫甘薯花色苷的輔色作用研究[J]．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(3)：98-102

[13]鄧潔紅．刺葡萄皮色素的研究[D]．長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007

[14]彭常安，姜雯翔，袁嘩，等.外源綠原酸對(duì)黑莓汁花色苷的輔色效果[J]．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27(6)：1357-1362

[15]任玉林，李華，邴貴德，等．天然食用色素花色苷[J]．食品科學(xué)，1995，16(7)：22-27

[16]王鋒，鄧潔紅，譚興和，等．花色苷及其共色作用研究進(jìn)展[J]．食品科學(xué)，2008，29：472-476

[17]楊振東．紫玉米芯花色苷提取工藝與組分分析及穩(wěn)定性研究[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008

[18]Dyrby M, Westergaard N, Stapelfeldt H. Light and heat sensitivity of red cabbage extract in soft drink model systems[J]. Food Chemistry, 2001, 72: 431-437

[19]Kirca A, Cemeroglu B. Degradation kinetics of anthocyanins in blood orange juice and concentrate[J]. Food Chemistry, 2003, 81:583-587

[20]Gradinaru G, Biliaderis C G, Kallithraka S, et a1. Thermal stability of Hibiscus sabdariffa L. anthocyanins in solution and in solid state: effect of copigmentation and glass transition[J]. Food Chemistry, 2003, 83(3):423-436

[21]Rein M J. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins [D]. Helsinki(Finland):University of Helsinki, 2005: 87

[22]Ochoa M R,Kesseler A G,Michelis A D, et al. Kinetics of colour change of raspberry, sweet(prunus avium)and sour (prunuscerasus)cherries preserves packed in glass containers: light and room temperature effects[J]. Journal of Food Engineering, 2001, 49(1):55-62

[23]Attoe E L, Von Elbe J H. Photochemical degradation of betanine and selected anthocyanins[J]. Journal of Food Science, 1981, 46:1934-1937.

[24]王清濱，陳國(guó)良．食品著色劑及其分析方法[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：97-99

[25]Kim H J, Tsoy I, Park J M, et al. Anthocyanins from soybean seed coat inhibit the expression of TNF-α-induced genes associated with ischemia/reperfusion in endothelial cell by NF-κB-dependent pathway and reduce rat myocardial damages incurred by ischemia and reperfusion in vivo[J]. FEBS Letters, 2006, 580:1391-1397.