魯忠富,胡耀文,汪寶根,吳曉花,徐 沛,李國景

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

干旱脅迫下長(zhǎng)豇豆莖干持綠性的關(guān)聯(lián)分析

魯忠富,胡耀文,汪寶根,吳曉花,徐 沛,李國景

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

利用已建立的快速、準(zhǔn)確的長(zhǎng)豇豆種質(zhì)苗期耐旱性鑒定技術(shù)體系鑒定了我國99份長(zhǎng)豇豆微核心種質(zhì)的重要耐旱性指標(biāo)莖干持綠性。利用覆蓋全基因組的1127個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行核心種質(zhì)群體的基因型分析和表型-標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析,獲得與莖干持綠性顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記4個(gè)（P＜10-4）。

長(zhǎng)豇豆；耐旱；莖干持綠性；SNP；關(guān)聯(lián)分析

豇豆［Vignaunguiculata（L.）Walp］起源于非洲,是重要的豆類作物。長(zhǎng)豇豆（V. sesquipedalis）是豇豆的一個(gè)重要亞種,廣泛種植于東南亞與中國各地。目前我國長(zhǎng)豇豆年栽培面積在20萬hm2以上,主要于夏秋季種植,以采摘嫩莢作為菜用。由于種植季節(jié)正值高溫,干旱成為制約長(zhǎng)豇豆生產(chǎn)的重要因素,嚴(yán)重影響長(zhǎng)豇豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。挖掘、應(yīng)用長(zhǎng)豇豆耐旱基因是解決這一問題的重要手段［1］。

莖干持綠性（Stg）是指植物在遇干旱脅迫時(shí)能夠在一定時(shí)期內(nèi)保持其莖干葉綠素不被破壞,維持細(xì)胞正常生命功能的性狀。該性狀已被證明可作為豇豆、高粱、大麥等作物重要的耐旱性指標(biāo),并且具有測(cè)定簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)［2］。關(guān)聯(lián)分析是利用不同基因座等位變異（基因）間的連鎖不平衡關(guān)系進(jìn)行標(biāo)記與性狀的相關(guān)性分析的遺傳學(xué)方法,以達(dá)到鑒定控制特定性狀基因（或染色體區(qū)段）的目的［3］。連鎖不平衡是指群體內(nèi)不同基因座基因間的非隨機(jī)性關(guān)聯(lián)。關(guān)聯(lián)分析已被廣泛用于動(dòng)植物重要性狀基因的挖掘、鑒定工作［4］。本研究即利用基于SNP標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析開展豇豆耐旱性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

以我國長(zhǎng)豇豆微核心種質(zhì)群體中的99份種質(zhì)為研究材料。

1.2 處理設(shè)計(jì)

種質(zhì)材料直播于盆缽中,在玻璃溫室中栽培。基質(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石（1∶1）的混合物。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組2個(gè)重復(fù),干旱處理組3個(gè)重復(fù)。各盆缽中均用量器量取等量基質(zhì)裝填,播種時(shí)各播5粒種子,待第1對(duì)真葉平展后留取2株健壯一致的幼苗。脅迫處理前每盆缽每次均用等量且過量的水澆透基質(zhì)。干旱處理組播種后18d停止?jié)菜M(jìn)行脅迫處理,在脅迫后第24d進(jìn)行莖干持綠性表型觀察。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 基因型測(cè)定

DNA提取。取各材料葉片組織0.1g加液氮研磨成粉末,用Qiagene試劑盒參照說明書提取DNA。

基因型測(cè)定。用Kaspar豇豆DNA高通量SNP基因分型平臺(tái)進(jìn)行基因型分析,具體方法參考文獻(xiàn)［5］。

1.3.2 莖干持綠性鑒定

將Stg分成0-5級(jí)：0級(jí),莖干正常,無失綠；1級(jí),≤20%莖干失綠；2級(jí),20%～40%莖干失綠；3級(jí),40%～60%莖干失綠；4級(jí), 60%～80%莖干失綠；5級(jí)：＞80%莖干失綠至完全枯黃［6］。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析采利用Tassel2.1軟件進(jìn)行,在混合線性模型（MLM）下進(jìn)行運(yùn)算。所用群體的群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系系數(shù)采用文獻(xiàn)［5］的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

對(duì)正常對(duì)照和干旱處理?xiàng)l件下豇豆微核心種質(zhì)群體的Stg調(diào)查結(jié)果（圖1）顯示,對(duì)照組沒有特征性的統(tǒng)計(jì)分布趨勢(shì),其Stg變異主要由品種的葉綠素含量高低造成。而干旱處理組則呈現(xiàn)偏向低值的近正態(tài)分布的特點(diǎn),表明干旱脅迫處理對(duì)多數(shù)植株造成了較重的脅迫,并且群體的Stg分布規(guī)律明顯,適宜進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖分析。表1列出了對(duì)照和處理組豇豆微核心種質(zhì)群體莖干持綠性描述統(tǒng)計(jì)值。

圖1 正常對(duì)照和干旱處理下豇豆微核心種質(zhì)群體的Stg值頻率分布

表1 正常對(duì)照和干旱處理下豇豆微核心種質(zhì)群體莖干持綠性描述結(jié)果

利用由高通量IlluminaGoldenGateSNP基因型檢測(cè)平臺(tái)轉(zhuǎn)化而來的KsaparSNP基因型檢測(cè)平臺(tái)高通量檢測(cè)了99份材料1127個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。結(jié)果表明,有1102個(gè)SNP成功檢測(cè)到信號(hào),技術(shù)成功率為97.7%。1102個(gè)SNP中,有8個(gè)SNP在群體中缺失信號(hào)超過20%,5個(gè)SNP在10%以上的材料中為雜合基因型,247個(gè)SNP在群體中無多態(tài),420個(gè)SNP的次要等位位點(diǎn)頻率值＜0.1。在去除上述低質(zhì)量或低信息量SNP位點(diǎn)后,有422個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)被用于連鎖不平衡分析。SNPs在群體中呈雙等位位點(diǎn)和連續(xù)頻率分布,頻率分布峰值在0.1～0.18。

采用Tassel軟件的MLM關(guān)聯(lián)分析表明,以Stg為指標(biāo)能在處理組中檢測(cè)到4個(gè)顯著性位點(diǎn)（P= 10-4）,但在對(duì)照組不能檢測(cè)到顯著性位點(diǎn)。顯著性位點(diǎn)及其P值見表2。

根據(jù)文獻(xiàn)［7］,這4個(gè)標(biāo)記中1-1162位點(diǎn)定位于LG3上,其他3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)定位到了普通豇豆整合遺傳圖譜上［8］,其中1-1481和1-1021位點(diǎn)均定位于LG2上且緊密連鎖,1-1286位點(diǎn)定位于LG10上。

表2 利用MLM關(guān)聯(lián)分析獲得的顯著性位點(diǎn)（P＜10-4）

3 小結(jié)和討論

本研究利用MLM方法檢測(cè)到了4個(gè)與豇豆莖干持綠性關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),這些位點(diǎn)將作為潛在的分子標(biāo)記位點(diǎn)用于今后的輔助育種。當(dāng)前的工作正考慮利用傳統(tǒng)QTL定位方法分析這些顯著性位點(diǎn)與耐旱性相關(guān)QTL是否存在共定位關(guān)系。另外,由于SNP標(biāo)記在實(shí)際育種中不如PCR標(biāo)記簡(jiǎn)便,后續(xù)工作將考慮將SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為PCR標(biāo)記［9］。轉(zhuǎn)化成功后利用轉(zhuǎn)化的PCR標(biāo)記只需通過檢測(cè)豇豆材料的基因組內(nèi)是否存在與控制莖干持綠性的耐熱/旱基因顯著關(guān)聯(lián)的特異DNA片段,即可在苗期輔助快速確定該材料是否具對(duì)干旱脅迫的耐受性。

在普通豇豆耐旱性研究中,除莖干持綠性外,單葉和第1三出復(fù)葉衰老、植株萎蔫程度、三出復(fù)葉相對(duì)含水量、葉片最大光化學(xué)效率等指標(biāo)也已被用于耐旱性研究。后續(xù)工作中將繼續(xù)開展上述指標(biāo)與長(zhǎng)豇豆耐旱性的關(guān)系研究,以期獲得更多與耐旱性關(guān)聯(lián)更緊密的標(biāo)記位點(diǎn)。

［1］ 汪寶根,劉永華,吳曉花,等.干旱脅迫下長(zhǎng)豇豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)與品種耐旱性的關(guān)系［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009,21（3）：246-249.

［2］ MucheroW,EhlersJD,RobertsPA.Restrictionsite polymorphism-basedcandidategenemappingforseedlingdrought toleranceincowpea［Vignaunguiculata（L.）.Walp.］［J］. TheorApplGenet,2010,120（3）：509-518.

［3］ ShuX,BackesG,RasmussenSK.Genome-wideassociationstudy ofresistantstarch（RS）phenotypesinabarleyvarietycollection［J］.JAgricFoodChem,2012,60（41）：10302-10311.

［4］ MucheroW,RobertsPA,DiopNN,etal.Geneticarchitectureof delayedsenescence,biomass,andgrainyieldunderdroughtstress incowpea［J］.PLoSOne,2013,8（7）：e70041.

［5］ XuP,WuX,WangB,etal.Genomewidelinkage disequilibriuminChineseasparagusbean（Vigna.unguiculata ssp.sesquipedialis）germplasm：implicationsfordomestication historyandgenomewideassociationstudies［J］.Heredity, 2012,109（1）：34-40.

［6］ MucheroW,EhlersJD,CloseTJ,etal.MappingQTLfor droughtstress-inducedprematuresenescenceandmaturityin cowpea［Vignaunguiculata（L.）Walp.］［J］.TheorAppl Genet,2009,118（5）：849-863.

［7］ XuP,WuX,WangB,etal.ASNPandSSRbasedgenetic mapofasparagusbean（Vigna.unguiculatassp.sesquipedialis）andcomparisonwiththebroaderspecies［J］.PLoSOne, 2011,6（1）：15952.

［8］ MucheroW,DiopNN,BhatPR,etal.Aconsensusgenetic mapofcowpea［Vignaunguiculata（L）Walp.］andsynteny basedonEST-derivedSNPs［J］.ProcNatlAcadSci,2009, 106（43）：18159-18164.

［9］ LiG,LiuY,EhlersJD,etal.IdentificationofanAFLP fragmentlinkedtorustresistanceinasparagusbeanandits conversiontoaSCARmarker［J］.HortScience,2007,42：1153-1156.

（責(zé)任編輯：張才德）

S643.4

A

0528-9017（2014）02-0202-02

文獻(xiàn)著錄格式：魯忠富,胡耀文,汪寶根,等.干旱脅迫下長(zhǎng)豇豆莖干持綠性的關(guān)聯(lián)分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（2）：202-203,207

2013-12-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30900985）

魯忠富（1963-）,男,浙江杭州人,實(shí)驗(yàn)師,從事蔬菜育種及新品種推廣工作。E-mail：lzf0522@163.com。

李國景。E-mail：Guojing-li@yahoo.com.cn。