劉進平，何永吉，王 蘭

河南華溪蟹金屬硫蛋白分泌型表達載體的構建、表達及純化

劉進平，何永吉，王 蘭*

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

目的：構建河南華溪蟹金屬硫蛋白（metallothionein，MT）分泌型表達載體并誘導其可溶表達。方法：采用基因重 組技術，將河南華溪蟹MT基因亞克隆至堿性磷酸鹽啟動子（alkaline phosphatase promoter，phoA）分泌型原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），通過低磷酸鹽誘導重組蛋白表達，經(jīng)Ni2+螯合柱分離純化后，利用紫外光譜掃描分析、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）及Western blotting檢測鑒定重組MT。結果：phoA-MT分泌型表達載體構建成功，工程菌經(jīng) 低磷酸鹽誘導后重組MT以可溶形式獲得表達，紫外光譜掃描和Western blotting證實表達產(chǎn)物的正確性，SDS-PAGE分析其純度較高，主要以單體和二聚體的形式存在，其分子質(zhì)量分別約為7.5、15 kD。結論：成功實現(xiàn)了河南華溪蟹MT的重組表達。

河南華溪蟹；金屬硫蛋白；表達

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類分布廣泛，分子質(zhì)量較?。? 000～7 000 D），富含半胱氨酸，無芳香族氨基酸和組氨酸，能結合Cd、Cu、Zn等多種金屬離子的非酶類蛋白質(zhì)[1-3]。1957年哈佛大學的Margoshes等[4]首次從馬腎中分離出這種蛋白質(zhì)并為其命名。研究表明，MT具有重金屬解毒、平衡體內(nèi)必需金屬元素、清除自由基以及延緩 衰老、抗腫瘤等作用[5-6]，是一種重要的藥用蛋白資源[7]?，F(xiàn)有的金屬 硫蛋白主要通過哺乳動物肝臟提取[8]，產(chǎn)量低、成本高、工藝復雜[9]。也有報道從酵母菌、脈孢菌、蟲草菌中提取，但同樣受制于表達水平較低，難以獲得理想的收率[10]。隨著生物技術的發(fā)展，利用蛋白質(zhì)工程技術實現(xiàn)重組MT的規(guī)?；苽涑蔀橐环N可能。

河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）由海洋蟹多元轉(zhuǎn)化而成，屬于甲殼綱、十足目 中一個特殊分支。作為生活于水體基底層的低等生物，溪蟹直接面對沉積在水體的金屬離子，其金屬硫蛋白的作用更為凸顯。已有文獻證明，溪蟹是一種理想的水環(huán)境監(jiān)測指示生物，而MT是一類可客觀表征水環(huán)境重金屬污染的生物指標[11-12]。本課題組前期研究結果也表明，河南華溪蟹MT具有較強的金屬結合能力和獨特的金屬結合特性，它既可以作為一種藥用蛋白，又可以應用于重金屬污染環(huán)境監(jiān)測和環(huán)境污染治理中，具有廣闊的應用前景[13]。

本實驗利用基因重組技術，將河南華溪蟹MT基因亞克隆至堿性磷酸鹽啟動子（alkaline phosphatase promoter，phoA）分泌型表達載體，構建phoA-MT重組表達質(zhì)粒，導入大腸桿菌，利用低磷酸鹽誘導，實現(xiàn)了河南華溪蟹重組MT蛋白的體外表達，以期為MT生物學功能的深入研究以及其 在 環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)藥、保健品和化妝品方面的規(guī)?；瘧玫於?基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pGEM-T-MT質(zhì)粒（含河南華溪蟹MT cDNA ORF序列，由本實驗室構建）、大腸桿菌BL21（DE3）、表達載體phoA（具有氨芐抗性，多克隆位點前含有堿性磷酸酶啟動子和信號序列，在低磷酸鹽誘導下表達重組蛋白，多克隆位點 3’端帶有6×His tag）均由本實驗室保存。

質(zhì)粒小抽提取試劑盒、膠回收試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；DNA Mark er 美國Thermo公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、BamHⅠ 大連寶生物公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.22 μm） 美國Bio-Rad公司；Anti-6×His tag兔源多抗、羊抗兔IgG/AP二抗 生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化硝基四氮唑藍（nitro tetrazolium blue chloride，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）顯色劑 美國Amresco公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

C1000溫度梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Bio-Rad基因?qū)腚娹D(zhuǎn)儀 美國Bio-Rad公司；Mikro 120小型臺式離心機 德國Hettich公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海醫(yī)療器械七廠；HZQ-C空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；Tanon-2500全自動凝膠成像系統(tǒng) 上海圣科儀器設備有限公司；DYY-BC型電泳儀 北京市六一儀器廠；TX2202L電子天平 上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

依據(jù)河南華溪蟹MT cDNA序列，利用Primer 5軟件設計引物P1、P2，分別在P1、P2兩端引入NcoⅠ、BamHⅠ酶切位點，PCR擴增產(chǎn)物理論值大小為190 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1：5’-GCC ATG GCC CCT GAT CCT TGC TGC-3’（下劃線為NcoⅠ的酶切位點）；下游引物為 P2：5’-AGG ATC CGG GGC AGC AGG AGC AAG-3’（下劃線為BamHⅠ的酶切位點）。

1.3.2 重組質(zhì) 粒的構建及鑒定

以質(zhì)粒pGEM-T-MT為模板，以P1、P2為引物，PCR反應條 件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；65 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段。利用NcoⅠ和BamHⅠ 雙酶切MT基因后連接至經(jīng)同樣雙酶切的phoA載體，構建重組表達質(zhì)粒phoA-MT。將重組質(zhì)粒phoA-MT轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于Luria-Bertani（LB）瓊脂平板（含50 mg/L氨芐青霉素），37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性單克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進行菌落PCR及質(zhì)粒酶切鑒定。重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 重組蛋白的誘導表達、純化

取重組表達質(zhì)粒phoA-MT按照標準方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)肽大腸桿菌BL21（DE3），構建大腸桿菌工程菌株phoA-MT/BL21（DE3）。將工程菌接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h制備種子。按照2.5%分別接種至高磷培養(yǎng)基（5 g/L 酶母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl、含磷量10 mmol/L）、低磷培養(yǎng)基1（1 g/L 酶母提取物、5 g/L 胰蛋白胨、3 g/L (NH4)2SO4、5 g/L NaCl、1 g/L MgSO4、4 g/L葡萄糖、含磷量0.1 mmol/L）、低磷培養(yǎng)基2（0.25 g/L酶母提取物、2.5 g/L胰蛋白胨、3 g/L (NH4)2SO4、5 g/L NaCl、1 g/L MgSO4、4 g/L葡萄糖、含磷量0.05 mmol/L）誘導，同時加入1 mmol/L ZnSO4，30 ℃、180 r/min誘導培養(yǎng)。鉬酸銨分光光度法測磷含量，OD600nm測定菌體密度，優(yōu)化培養(yǎng)時間和誘導培養(yǎng)基。待工程菌培養(yǎng)液上清液中磷全部消耗完畢，4 ℃、8 000 r/min離心25 min收集細菌。每1 g濕菌用5 mL的破碎液（20 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、體積分數(shù)1%的Trionton-80、10mmol/L咪唑，pH 7.8）重懸，冰浴攪拌30 min，冰水浴間歇超聲波（360～400 W）處理至菌液無黏性，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，收集上清液。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后利用Ni2+SepharoseTM6 Fast Flow親和層析柱分離純化。首先將過濾后上清液上柱于緩沖液（20 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH 7.8）平衡好的Ni2+SepharoseTM6 Fast Flow柱，再用平衡緩沖液洗至基線，然后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，pH 7.8）洗脫雜蛋白，最后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH 7.8）洗脫目的蛋白峰。洗脫峰組分經(jīng)3 000 MWCO超濾管超濾濃縮至儲存液（100 mmol/L Tris-HCl，0.2 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）， 10 mmol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），pH 8.6）。利用16.5% Tricine-SDS-PAGE電泳分析各純化組分。

1.3.4 紫外光譜掃描分析

純化的重組MT超濾濃縮樣采用UNICO UV-2102 PC型紫外-可見分 光光度計全波長進行紫外光譜掃描分析。

1.3.5 Western blotting檢測

重 組MT蛋白純化樣 經(jīng)16.5% Tricine-SDS-PAGE電泳分析后，用電轉(zhuǎn)儀將SDS-PAGE 膠中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液（磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffered saline-tween，PBST）+5%脫脂奶粉） 4 ℃過夜封閉，PBST洗膜 4 次，10 min/次，加入1∶1 000稀釋的Anti-6×His tag兔源多抗，4 ℃過夜，PBST洗膜4 次后，加入 1∶5 000稀釋的堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG，室溫反應2 h，用PBST 洗膜4 次后，最后用NBT/ BCIP 顯色試劑盒避光顯色并拍照。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

圖1 河南華溪蟹MT基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 PCR amplification of the crab MT gene

PCR產(chǎn)物理論序列為：5’-GCC ATG GCC-5-CCT GAT CCT TGC TGC ACA GAA GGA ACG TGC GAG TGT GCT GAG GGC AAG TGC AAG TCA GGG TGT AAG TGC ACC TCC TGT CGC TGT TCT CCT TGC GAG AAA TGC AAA TCC GAG TGC AAG TGC AGC ACC GCG GAG GAA TGC GCC AAG AAC TGC ACG AAG CCT TGC TCC TGC TGC CCC-3-GGA TCC T-3’，其反補序列為：5’-AGG ATC C5-GGG GCA GCA GGA GCA AGG CTT CGT GCA GTT CTT GGC GCA TTC CTC CGC GGT GCT GCA CTT GCA CTC GGA TTT GCA TTT CTC GCA AGG AGA ACA GCG ACA GGA GGT GCA CTT ACA CCC TGA CTT GCA CTT GCC CTC AGC ACA CTC GCA CGT TCC TTC TGT GCA GCA AGG ATC AGG-3-GGC CAT GGC-3’，擴增出的PCR產(chǎn)物精確大小應為：174 bp+16 bp =190 bp。

由圖1可知，以河南華溪蟹MT基因為模板、P1和P2為引物PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結果發(fā)現(xiàn)在200 bp左右出現(xiàn)1 條清晰的條帶，與預期目的片段190 bp一致。

2.2 重組表達載體的構建及鑒定

圖2 重組質(zhì)粒phoA-MT雙酶切鑒定及菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid phoA-MT by restriction enzyme digestion and PCR

如圖2所示，重組質(zhì)粒phoA-MT經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切后產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。phoA質(zhì)粒大小為3 076 bp，MT基因大小為190 bp，故重組質(zhì)粒phoA-MT應為3 250 bp左右。電泳結果顯示，未酶切的重組質(zhì)粒只有1 條DNA片段，而雙酶切后出現(xiàn)了3 000 bp和 200 bp兩條DNA條帶。同時，以重組菌為模板，以P1、P2為引物的PCR產(chǎn)物，大小約為200 bp，與目的基因大小一致。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序結果也表明，重組質(zhì)粒phoA-MT構建成功，目的基因MT以正確的方式插入到phoA表達載體中。

2.3 重組蛋白的表達及純化

表1 重組MT在不同培養(yǎng)時間下大腸桿菌中的表達Table 1 Expression of recombinant MT inE.coli.coli

將重組質(zhì)粒phoA-MT轉(zhuǎn)化至表達菌株BL21（DE3）后，分別接種至高磷培養(yǎng)基、低磷液體培養(yǎng)基1、2，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)，鉬酸銨分光光度法[14-15]測定磷含量，OD600nm測定菌體生長密度，優(yōu)化表達條件。測定結果如表1所示，當利用低磷培養(yǎng)基2誘導表達菌株時，24 h磷含量已經(jīng)完全耗盡，菌體量OD600nm可達2.710。

圖3 SDS-PAGE分析重組MT表達及純化Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant MT

如圖3所示，按照體積分數(shù)2.5%接種工程菌phoAMT/BL21（DE3）至低磷培養(yǎng)基2，加入1 mmol/L ZnSO4，30 ℃誘導24 h。8 000 r/min離心25 min收集表達菌體，并超聲破碎。利用BandScan軟件對圖3中的1、2號泳道進行蛋白薄層掃描分析，掃描結果顯示，重組蛋白MT（包括單體（7.5 kD）和二聚體（15 kD））占總蛋白的15%左右。上清液經(jīng)Ni2+SepharoseTM6 Fast Flow親和層析分離，50、80、250 mmol/L咪唑梯度洗脫，16.5% Tricine-SDS-PAGE電泳分析各純化步驟樣品，結果表明當咪唑濃度為250 mmol/L時，目的蛋白被洗脫。據(jù)文獻[16]研究顯示Zn-MT在較高pH值條件下較穩(wěn)定，因此洗脫樣品經(jīng)3 000 MWCO超濾管超濾濃縮至儲存液（100 mmol/L Tris-HCl，0.2 mmol/L PMSF，10 mmol/L DTT，pH 8.6）。

2.4 重組蛋白的紫外光譜掃描及Western blotting分析

如圖4所示，金屬硫蛋白MT因缺乏芳香族氨基酸，故無280 nm處的吸收峰，但具有與金屬有關的吸收峰。MT結合不同的金屬具有不同的吸收峰，據(jù)此可鑒定不同的MT。去金屬的MT在190 nm處有一吸收峰。無論是自然產(chǎn)生還是誘導產(chǎn)生的MT，其氨基酸組成基本相同，其主要不同在于所含金屬的種類和金屬的含量。重組MT在全波長下進行紫外掃描，結果表明重組蛋白由于結合了Zn2+，在220 nm附近有明顯吸收峰，而無280 nm常規(guī)蛋白的特征吸收峰，與相關文獻報道Zn-MT紫外光譜特征一致[17]。

圖4 重組MT純化樣品紫外掃描光譜Fig.4 UV absorption spectrum of recombinant MT

圖5 重組MT Western blottingFig.5 Weste rn blotting of recombinant MT

如圖5所示，純化的重組MT電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜后，可被Anti-6×His tag兔源多抗特異性識別，進一步驗證了重組蛋白的正確性。

3 討 論

外源基因在原核細胞中的表達，是基因工程和分子生物學許多研究領域中應用最為廣泛的技術，而利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備重組蛋白是目前獲取大量外源蛋白的首選。然而，目前利用重組技術制備MT獲得了重組表達，但依然存在諸多問題。主要是由于MT分子質(zhì)量較小，半衰期短，在大腸桿菌體內(nèi)不穩(wěn)定且易被酶降解；且MT富含半胱氨酸，極易形成無生物活性的包涵體。同時由于MT在大腸桿菌內(nèi)極不穩(wěn)定，其具有很強的金屬結合特性，易螯合體內(nèi)必需金屬元素而對宿主細胞產(chǎn)生較大的毒性等問題，一直難以獲得比較高的產(chǎn)率[18]。在前期研究中，將河南華溪蟹MT基因亞克隆至PET-28a、PQE30等一系列常規(guī)表達載體上，發(fā)現(xiàn)其無法正常表達[19]，這也進一步驗證了MT由于其獨特的性質(zhì)而較難獲得重組表達的推理，與曹曉敏[20]和Zhang Fengqin[21]等研究結果一致。

為解決這一問題，很多研究者通過將MT融合于具有協(xié)助蛋白正確折疊的融合蛋白如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶或麥芽糖結合蛋白[22]以及SUMO標簽融合表達。雖然這種方法從一定程度上解決了蛋白可溶性的問題，提高了蛋白回收率，但由于蛋白酶比較昂貴、酶切耗時等問題，限制了其使用。也有學者通過將MT融合外膜蛋白LamB、OmpA或跨膜蛋白PAL表達至細胞外膜，不會干擾和影響胞內(nèi)的正常生理代謝，從而實現(xiàn)重組表達。然而，這兩種重組表達均需要融合較大的外源基因片段而實現(xiàn)，容易對MT的功能及結構產(chǎn)生影響。phoA系統(tǒng)是一種利用phoA啟動子和信號序列將外源蛋白分泌表達至大腸桿菌細胞周至間的重組表達系統(tǒng)，可以最大程度保持外源蛋白的天然構象[23-24]，同時分泌至外周質(zhì)的蛋白質(zhì)更為穩(wěn)定[25-26]。在phoA表達系統(tǒng)中，phoA基因編碼大腸桿菌磷酸清除系統(tǒng)的堿性磷酸酶，在過量磷酸鹽存在時被抑制，在饑餓的狀態(tài)下（細菌生長進入遲滯期），Kikuchi等[27]研究表明phoA啟動子下游區(qū)的β-半乳糖苷酶基因只有在低磷酸鹽濃度下才能表達，phoA基因逐漸被誘導。這種調(diào)控使外源蛋白在細胞內(nèi)的積累是漸進的，不像其他啟動子調(diào)控的急速積累。這種慢性積累降低了細菌表達系統(tǒng)過載和形成包涵體的機會。同時慢速積累也使急速積累時產(chǎn)生毒性的外源蛋白得以緩解、獲得表達。本實驗成功利用phoA表達系統(tǒng)將河南華溪蟹MT蛋白分泌表達至細胞周質(zhì)中，降低了MT的細胞毒性，同時最大程度的保證MT的天然構象，實現(xiàn)了河南華溪蟹MT蛋白的分泌可溶表達。在該表達過程中，phoA信號序列將MT轉(zhuǎn)運至周至時被自動切除，最終的表達產(chǎn)物為僅C端融合有6×His tag小肽的重組華溪蟹MT蛋白，克服了MT蛋白分子質(zhì)量較小、毒性較大而難以 表達的問題。此外，MT的存在形式及穩(wěn)定性與它是否結合了金屬、所結合金屬的種類及環(huán)境的pH值密切相關。侯廷軍等[28]通過蛋白質(zhì)溶液動態(tài)光散射實驗發(fā)現(xiàn)MT在不同溶液中，不同pH值條件下，其具有不同形式的聚合狀態(tài)；且在100 mmol/L Tris-HCl體系中（pH 8.6），Zn-MT主要以較為穩(wěn)定的單體和二聚體形式存在。本實驗中重組MT蛋白主要以單體和二聚體形式存在的結果，既與侯廷軍等[28]的研究結果相符，也與前期天然MT蛋白純化結果相一致。

本實驗采用phoA分泌型表達載體，構建phoA-MT重組表達質(zhì)粒，導入大腸桿菌，實現(xiàn)了河南華溪蟹重組MT蛋白的體外原核表達，為MT生物學功能的深入研究及規(guī)?；瘧玫於嘶A。

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Expressi on of Secreted Metallothionein of Sinopotamon henanense Using Alkaline Phosphatase Promoter (phoA) and Signal Sequence in Escherichia coli

LIU Jin-ping, HE Yong-ji, WANG Lan*
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this research we aimed to obtain soluble metallothionein (MT) of Sinopotamon henanense. Therefore, a recombinant phoA plasmid containing MT open reading frame fused with a 6×His tag was constructed. The plasmid possessed the promoter and signal sequence of the a lkal ine phosphatase gene of Escherichia coli. Subsequently, the recombinant phoA-MT vector was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain for MT expression. The fusion protein induced by a low concentration of phosphate was purified by Ni2+affinity chromatography and analyzed by UV absorption spectrometry, SDS-PAGE and Western blotting. The results demonstrated that fusion protein was expressed with high purity as a m onomer and a dimmer, with molec ular weight of a p proximately 7.5 and 15 kD, respectively.

Sinopotamon henanen se; metallothionein; expression

Q786

A

1002-6630（2014）17-0128-05

10.7506/spkx1002-6630-201417026

2013-11-08

國家自然科學基金面上項目（30970361）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20111401110010）；山西省自然科學基金項目（2010011043-2）

劉進平（1985—），女，碩士研究生，研究方向為動物解毒蛋白的生化機理。E-mail：pinger0428@163.com

*通信作者：王蘭（1960—），女，教授，博士，研究方向為典型重金屬污染物的生物學效應與分子機制。E-mail：lanwang@sxu.edu.cn