柳愛(ài)姿，包曉辰，方以群，桑仲娜，李華江，張萬(wàn)起△

（1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2.海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海200433；3.海軍司令部航海保證部綜合辦，天津300042）

臨床上經(jīng)常采用氧氣治療各種缺氧性疾病，高壓氧氣被用來(lái)治療減壓病、股骨頭壞死等疾?。?］。但長(zhǎng)時(shí)間暴露于氧氣中會(huì)導(dǎo)致氧中毒的發(fā)生，其中較為常見(jiàn)的是肺型氧中毒［2］。

目前，認(rèn)為氧自由基是導(dǎo)致氧中毒發(fā)生的主要原因［3］。但最近有文獻(xiàn)報(bào)道高壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒和常壓氧（1 ATA，100%氧氣）導(dǎo)致的肺型氧中毒存在不同的發(fā)病機(jī)制，而不同的一氧化氮合成酶（eNOS，nNOS）可能在兩種肺型氧中毒中各自起著主要作用［4］。因此Demchenko IT等學(xué)者認(rèn)為兩者存在不同的發(fā)病機(jī)制［5，6］。本文擬通過(guò)檢測(cè)不同壓力氧氣暴露下大鼠肺組織中eNOS、nNOS的表達(dá)變化，探討常壓氧及高壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒的不同發(fā)病特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

60只雄性SD大鼠，體重200 g左右，6周。購(gòu)買(mǎi)于上海畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。實(shí)驗(yàn)前1周飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心。動(dòng)物隨機(jī)分為6組（n＝10），分別是對(duì)照組、1 ATA組、1.5 ATA組、2 ATA組、2.5 ATA組、3 ATA組。

1.2 試劑

eNOS、nNOS抗體購(gòu)自 Transduction Laboratories公司。BCA蛋白試劑盒購(gòu)自pierce公司。Gapdh抗體、ECL試劑盒購(gòu)自santa cruze公司。5x蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海生工。

1.3 氧暴露方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于氧艙中，氧艙內(nèi)放置CO2吸收劑。100%氧氣洗艙10 min后，氧流量監(jiān)測(cè)儀顯示氧氣濃度大于97%，加壓至實(shí)驗(yàn)壓力。1ATA組暴露56 h、1.5 ATA組暴露20 h、2 ATA組暴露10 h、2.5 ATA組暴露8 h、3 ATA組暴露6 h。

1.4 肺組織濕干比

取右下肺組織，先稱取各個(gè)肺組織的濕重。然后置于80°C烤箱中烘烤48 h后，稱取干重。計(jì)算濕／干重的比例（n＝5）。

1.5 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量測(cè)定

每組取5只大鼠，采用戊巴比妥鈉麻醉后（100 mg／kg，腹腔注射），逐層剪開(kāi)皮膚、分離主支氣管、剪T型切口。5 ml注射器抽取5 ml預(yù)冷的PBS，插入主支氣管，結(jié)扎固定后，反復(fù)抽吸5次，回收率達(dá)到60%以上（～3 ml）。收獲的支氣管肺泡灌洗液1 000，4℃離心10 min后，收集上清儲(chǔ)存在70℃冰箱。灌洗液蛋白測(cè)定按照Pierce BCA蛋白試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白

動(dòng)物麻醉后，取肺組織，在蛋白裂解液中裂解（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）containing 0.2 mmol／L phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF），0.15μmol／L pepstatin A，20μmol／L leupeptin，and 1 mmol／L sodium orthovanadate后，1 000 g，4°C離心10 min后，取上清，測(cè)定蛋白含量。蛋白樣品加入5x上樣緩沖液，100°C煮沸5 min。等量樣品加入電泳槽中，濃縮膠90 V電泳15 min，10%分離膠120 V電泳90 min后。400 mA恒流轉(zhuǎn)膜150 min后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別和一抗eNOS、nNOS（1∶1 000），gapdh（1∶8 000）4℃孵育過(guò)夜。TBST洗脫15 min×3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST洗脫15 min×3次，ECL液顯影，膠片曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)改變

1.0 ATA組大鼠無(wú)明顯的氧驚厥等癥狀，1.5 ATA組及2.0 ATA組大鼠有輕微的運(yùn)動(dòng)障礙。2.5 ATA組有1只大鼠（10%）出現(xiàn)抽搐，3.0 ATA組有2只（20%）出現(xiàn)氧驚厥。3.0 ATA組其余大鼠出現(xiàn)呼吸緩慢、肢體抽搐等癥狀。

2.2 肺濕干比及支氣管肺泡灌洗液蛋白量

正常對(duì)照組濕干比（4.99±0.15）相比較，1.0 ATA及1.5 ATA氧氣暴露組大鼠肺組織的濕干比明顯升高，分別是（6.72±0.35）（P＜0.01）和（5.72±0.19）（P＜0.05）。正常對(duì)照組肺泡灌洗液蛋白量為（380.84±68.41）μg／ml，1.0 ATA及 1.5 ATA氧氣暴露組大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量明顯升高，分別是（2432.78±651.77）μg／mL（P＜0.05）和（514.36±27.86）μg／mL（P＜0.05）。而 2.0 ATA、2.5 ATA及3.0 ATA組無(wú)明顯改變。和1.0 ATA氧氣暴露組比較，1.5 ATA、2.0 ATA、2.5 ATA及 3.0 ATA氧氣暴露組肺組織的濕干比及支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量均顯著降低（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Comparison of the lung injury score and ratio of wet and dry weight（W／D）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）albumin concentration levels

Tab.1 Comparison of the lung injury score and ratio of wet and dry weight（W／D）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）albumin concentration levels

*P＜0.05，**P＜0.01 vs shamgroup；＃＃P＜0.01 vs 1 ATA group

）Sham 4.99±0.15 380.84±68.41 1 ATA 6.72±0.35** 2432.78±651.77*1.5 ATA 5.72±0.19*＃＃ 514.36±27.86*＃＃2 ATA 5.26±0.40＃＃ 548.01±45.40＃＃2.5 ATA 4.99±0.34＃＃ 564.90±92.58＃＃3 ATA 5.43±0.56＃＃ 837.04±289.11 Group W／D Total protein in BALF（μg／mL＃＃

2.3 NOS的表達(dá)量

和正常對(duì)照組相比較，各個(gè)氧氣壓力暴露組大鼠肺組織中nNOS的含量沒(méi)有明顯改變（P＞0.05）。而eNOS含量則在氧氣壓力為2 ATA時(shí)明顯降低（P＜0.05），氧氣壓力為2.5 ATA及3 ATA時(shí)明顯增高（P＜0.05，圖 1）。

3 討 論

最近有文獻(xiàn)證實(shí)常壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒和高壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒可能存在不同的發(fā)病機(jī)制［4，5］，而NOS可能在其中起著重要的作用。本研究為了探討NOS在不同氧氣壓力導(dǎo)致的肺型氧中毒的表達(dá)變化，分別研究了6組不同壓力氧暴露下的大鼠肺組織的變化。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，不同的壓力暴露采用了不同的暴露時(shí)間，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考了 Demchenko IT等的實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)1 ATA氧氣暴露的半數(shù)致死量（LD50）時(shí)間為 69 h，1.5 ATA為 24.2 h，2 ATA為 14.2 h，2.5 ATA為 11.2 h，3 ATA為 8.3 h［4］。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了達(dá)到半數(shù)致死量時(shí)間的80%作為各個(gè)壓力的暴露時(shí)間，分別是1 ATA為 56 h、1.5 ATA為 20 h、2 ATA為 10 h、2.5 ATA為8 h、3 ATA為6 h。

Fig.1 Volume changes of the expression of nNOS and eNOS in lung tissue of rats in every group of proteins

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0 ATA氧導(dǎo)致的肺型氧中毒主要表現(xiàn)為肺部組織水腫、支氣管肺泡灌洗液蛋白含量增高。隨著氧分壓的增高，上述改變逐漸減弱。和1.0 ATA組相比較，1.5 ATA以上壓力組的肺水腫、灌洗液中蛋白含量明顯降低，提示常壓氧中毒和高壓氧中毒可能存在不同的發(fā)病機(jī)制。這個(gè)結(jié)果和Demchenko IT等的結(jié)果相似［4］，提示隨著氧分壓的增高，炎癥及肺水腫的癥狀逐漸減輕。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同氧氣壓力暴露下nNOS的表達(dá)無(wú)變化，而eNOS則在2 ATA時(shí)明顯下降，2.5 ATA及3 ATA時(shí)上調(diào)明顯。提示eNOS在高分壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒的發(fā)病機(jī)制中起著作用。eNOS是表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上的NO合成酶，在肺組織中廣泛表達(dá)，有文獻(xiàn)證實(shí)eNOS在氧中毒發(fā)病中起著重要作用［7］，高壓氧可增加內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS活性及NO的釋放［8，9］。Kondrikov等證實(shí)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上eNOS的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)高壓氧誘導(dǎo)的過(guò)氧亞硝酸鹽的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致肺血管床的亞硝酸應(yīng)激［9］。

結(jié)果表明eNOS在2 ATA時(shí)下降明顯，而在2.5 ATA及3 ATA時(shí)增高。目前認(rèn)為2 ATA以下的壓力導(dǎo)致的肺型氧中毒的發(fā)病表現(xiàn)類(lèi)似于常壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒，當(dāng)壓力超過(guò)2 ATA時(shí)，肺型氧中毒的發(fā)病特點(diǎn)出現(xiàn)了明顯變化，主要表現(xiàn)為肺部組織出血，而炎癥和滲出不明顯。因此我們認(rèn)為eNOS上調(diào)可能在超過(guò)2 ATA以上的氧氣導(dǎo)致的肺型氧中毒中起得作用更大。這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。

總結(jié)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出在達(dá)到半數(shù)致死量時(shí)間的80%作為各個(gè)壓力的暴露時(shí)間，相比于nNOS，eNOS在高分壓氧導(dǎo)致的肺型氧中毒中具有重要作用。肺濕干比、支氣管肺泡灌洗液蛋白量隨著氧氣壓力的變化而改變。

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