孫海燕

肝臟細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）氧化酶又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，廣泛存在于動物、植物、微生物的各種組織中，是負責大多數(shù)臨床藥物、環(huán)境致癌物、外源毒物及內源活性物質生物轉化的主要酶系統(tǒng)，具有重要的藥理、生理及病理學意義。CYP450 是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的基因超家族，由不同的基因家族和亞家族組成，其中與藥物代謝關系最為密切的主要有 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1 及 CYP3A4 等。本文綜述了炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性改變及其作用機制的研究進展。

1 CYP2B6 的功能特性

CYP2B6 是人類 CYP2B 亞家族的重要成員，廣泛分布于人體肝臟、腎臟、肺、小腸、子宮內膜、支氣管肺泡巨噬細胞等處，參與多種內源性和外源性物質的合成和代謝[1]。CYP2B6 蛋白質由 491 個氨基酸組成，相對分子質量為 58268。很長一段時期內，人們低估了 CYP2B6 在藥物代謝中的重要作用。近年來，隨著它的一系列特異性和靈敏度都很高的抗體被制備出來，以及大量底物的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸認識到它在 CYP 家族中扮演著十分重要的角色。眾多學者開始關注 CYP2B6 并進行了許多相關研究[2-3]。CYP2B6 介導了大約 8% 臨床藥物的代謝，其中包括如抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺、他莫昔芬，抗 HIV 感染的非核苷類反轉錄酶抑制劑依法韋侖，抗抑郁藥安非他酮、丙咪嗪，常用麻醉藥氯胺酮、異丙酚等，常用的濫用藥物如尼古丁和 4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮也是 CYP2B6 的底物[4]。除此之外，CYP2B6 還參與了很多毒物（如農藥）的代謝，是重要的外源性毒物代謝酶之一[5]。因此，穩(wěn)定的 CYP2B6活性是保障藥物治療安全有效的重要前提。

CYP2B6 是一個受遺傳、環(huán)境、種族和病理狀況等影響較大的 P450 酶，其在基因及蛋白水平表達上顯示出較大的個體差異，導致其對許多臨床藥物的代謝發(fā)生較大改變，甚至出現(xiàn)一系列毒副作用[6-7]。不同的病理狀況可以影響CYP2B6 的活性和蛋白表達，其中感染和炎癥對 CYP2B6的影響得到了較為深入的研究。

2 炎癥狀態(tài)與相關性疾病

炎癥是人類疾病中最常見的病理狀態(tài)。越來越多的研究表明，炎癥并不是一種單一的病理狀態(tài)，多種疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴有機體的炎癥狀態(tài)。例如感染、腫瘤、自身免疫缺陷、2 型糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化以及組織損傷等許多刺激都能誘導炎癥的發(fā)生，導致體內炎性細胞因子的升高。Liu 等[8]報道，超過 50% 的胃癌患者體內炎性細胞因子IL-1β 表達增加，Zhao 等[9]研究表明，皮膚癌小鼠模型中角質化細胞內 IL-1β 表達增強。臨床流行病學調查顯示艾滋病患者伴有體內 IL-1、IL-2、IL-6 等細胞因子的顯著升高。Leinonen 等[10]證明，2 型糖尿病患者的 CRP、IL-6 等炎性因子水平較正常對照組明顯升高，后證實 2 型糖尿病的發(fā)生伴隨著體內多種炎性因子的過量表達[11-12]。此外，文獻報道急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者血中炎性因子的增高與血管內皮脫落形成循環(huán)內皮細胞高度相關[13]。關于動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病機制曾有脂質浸潤學說、血小板聚集和血栓形成學說等，但目前也認為，AS 從發(fā)生、發(fā)展到轉歸的全過程就是一個慢性炎癥過程，眾多炎癥細胞和炎性介質參與其中[14]。

3 炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性和表達的影響

炎癥是機體最常見的一種病理狀態(tài)。因此科研工作者們相繼從轉錄及轉錄后水平開展了大量炎癥狀態(tài)對 CYP450的調節(jié)研究。20 世紀 80年代以來，美國 Emory 大學Edward T.Morgan 教授和他的科研團隊致力于研究感染和炎癥反應對 CYP450 的影響。其研究結果顯示，感染和炎癥條件下，人、大鼠和小鼠肝臟、腎臟和腦組織的細胞色素P450 酶表達和活性改變顯著。例如給小鼠腹腔注射脂多糖（LPS），LPS 能夠通過細胞的表面受體激活巨噬細胞，分泌大量促炎性細胞因子，繼而對多種 CYP450 亞型呈現(xiàn)抑制作用。給大鼠分別腹腔注射 IL-6 和 TNFγ 后，CYP2C11、CYP2E1 和 CYP3A2 的 mRNA 表達均下降。分別以人原代肝細胞和大鼠原代肝細胞等為實驗對象，用促炎性細胞因子 IL-1β 和 IL-6、TNFα 和細胞進行共孵育，發(fā)現(xiàn) 1A2、2A5、2B1、2B6、2B9、2B10、2C11、2C29、2E1、3A2、3A4、3A11 和 4A10 等 CYP 的蛋白表達量或活性都顯著降低，其中尤以對 CYP2B6 的影響非常顯著，提示炎癥能使經 CYP2B6 途徑藥物如環(huán)磷酰胺、依法韋侖和安非他酮等的體內代謝率顯著下降，消除半衰期延長，導致體內藥物蓄積而發(fā)生嚴重不良反應[15-19]。

4 炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性影響的機制研究

研究者對炎癥狀態(tài)下 CYP450 活性改變的機制也進行了一系列研究，以往的研究更多地關注炎性細胞因子對CYP450 的 mRNA 表達等轉錄水平的影響，后來大量實驗結果證實，炎性細胞因子在對 CYP450 mRNA 表達無影響的情況下，依然可以降低肝藥酶活性，提示轉錄后修飾在此過程中也扮演了重要的角色。

4.1 NO 在炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性改變中的作用

NO 是一種不穩(wěn)定的生物自由基，其生物活性最早發(fā)現(xiàn)于 1980年，美國科學家 Furchgott 和 Zawadzki[20]在一項研究中發(fā)現(xiàn)了一種小分子物質，具有使血管平滑肌松弛的作用，被命名為血管內皮細胞舒張因子（EDRF），后被確認為是 NO。NO 由體內一氧化氮合酶（NOS）催化，以 L-精氨酸和分子氧為底物合成。NOS 包括神經元型一氧化氮合酶（nNOS）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）三種亞型，感染和炎癥主要增加 iNOS的表達。

CYP2B6 在大鼠肝細胞主要以 CYP2B1 形式存在，與人肝細胞 CYP2B6 的基因有 76% 的相似。筆者近年來系統(tǒng)研究了炎性細胞因子 IL-1β 對大鼠 CYP2B1 的下調作用及其機制。實驗結果證實，IL-1β 與大鼠原代肝細胞共孵育，可顯著誘導 iNOS 的蛋白表達，增加 NO 的生成，并進而使 CYP2B1 蛋白質半胱氨酸的巰基亞硝基化，易于被泛素-蛋白酶體識別而快速降解[21-22]，提示 NO 和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在炎癥對 CYP2B6 的影響中起到了至關重要的作用，從轉錄后蛋白降解的水平闡述了 IL-1β 抑制CYP2B1 的機制。

4.2 蛋白質修飾在炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性改變中的作用

1992年，Stamler 等[23]發(fā)現(xiàn) NO 和活性氮（RNS）可以作用于蛋白質半胱氨酸的巰基（Cys-SH），生成 S-亞硝基化基團（Cys-SNO），引起蛋白質的活性與功能的改變，并首次提出了蛋白質巰基的 S-亞硝基化修飾概念[24]。Minamiyama 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，使用 NO 供體 NOC7 或過氧化亞硝酸鹽（ONOO-）和肝微粒體共孵育，可以引起 CYP450活性降低及游離巰基的減少。Roberts 等[26]也發(fā)現(xiàn) IL-1 可以使腎小球膜細胞中產生 ONOO-，繼而使 CYP8A1 和CYP2B1 的活性下降，研究者猜測是由于 ONOO-使CYP8A1 和 CYP2B1 酪氨酸殘基硝基化，降低了酶的催化活性。

要深入闡明 NO 對蛋白質的亞硝基化修飾作用，需要有高靈敏度和特異性的檢測方法。2001年，美國藥理學家 Jaffrey 和 Snyder 等[27]建立了一種生物素轉化的方法（Biotin switch）來進行 S-亞硝基化蛋白的檢測。該方法經過不斷的改進和完善，目前已得到國際公認[28]。Benhar等[29]成功利用該方法測定了人淋巴細胞中半胱天冬酶-3蛋白的亞硝基化修飾，并發(fā)現(xiàn)細胞質和線粒體中的硫氧還蛋白（thioredoxins，Trx）能夠降低去亞硝基化的過程。

除了亞硝基化外，NO 和 RNS 還可以對半胱氨酸的巰基進行次磺酸化（Cys-SOH）等氧化修飾。研究顯示，RNS可以使酪氨酸羥化酶的半胱氨酸次磺酸化，導致酶的活性下降[30]。GSNO 能夠對組織蛋白酶 K 的半胱氨酸進行次磺酸化修飾而改變酶的活性[31]。2008年，美國密歇根大學Reddie 教授等[32]利用新合成的特異性探針化合物 DAz-1，建立了一種新的次磺酸化蛋白檢測方法，為研究蛋白質的氧化修飾機制開辟了廣闊的前景。

2008年，Lee 等[33]用 NO 供體 GNSO 與大鼠肝微粒體體外共孵育，采用 Biotin switch 法檢測到經 S-亞硝基化修飾的 CYP2B1，并發(fā)現(xiàn)泛素化 CYP2B1 蛋白明顯增加，表明 NO 能夠對 CYP2B1 蛋白進行亞硝基化修飾，并促進其和泛素連接；實驗還發(fā)現(xiàn)另一 NO 供體 NOC18 和HeLa 細胞共孵育，能夠引起 CYP2B1 蛋白量下降，蛋白酶體（proteasome）抑制劑 MG132 可以明顯抑制這一過程，但溶酶體酶抑制劑和 Ca2+依賴性蛋白酶抑制劑對CYP2B1 蛋白的降解無影響，說明 NO 作用下 CYP2B1的降解通過泛素-蛋白酶體途徑進行。

4.3 泛素-蛋白酶體通路在炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性改變中的作用

泛素-蛋白酶體通路（Ub-proteasome system，UPS）是除溶酶體途徑、Ca2+依賴性蛋白酶途徑之外的另一種細胞內蛋白質選擇性降解的重要途徑，這一發(fā)現(xiàn)獲得了 2004年諾貝爾化學獎。該通路由泛素、蛋白酶體以及一系列相關的泛素激活酶 E1、泛素結合酶 E2 和泛素連接酶 E3 組成[34]。泛素是一種小分子球蛋白，能作為“標簽”結合到其他蛋白質上，蛋白質被亞硝基化或者次磺酸化修飾后易被泛素連接酶 E3 識別，使之成為蛋白酶體水解的底物。蛋白酶體是具有多亞基和多相催化活性的蛋白酶復合體，是催化泛素與底物蛋白偶聯(lián)體降解的關鍵酶，調節(jié)著細胞內蛋白的水平和功能[35]。

筆者近年研究發(fā)現(xiàn)，單純使用外源性 NO 供體藥物NOC18 同樣可以使大鼠原代肝細胞 CYP2B1 蛋白表達量下降，但降解過程比 IL-1 所致的 CYP2B1 蛋白量下降緩慢。有文獻報道 IL-1 可以誘導燒傷大鼠趾長伸肌中免疫蛋白酶體的蛋白水解活性和表達[36]。由此我們推測，IL-1 可能通過直接增強大鼠原代肝細胞蛋白酶體的活性或表達，加速了 CYP2B1 的蛋白降解。最近，我們利用特異性熒光多肽底物初步測定了 IL-1 對大鼠原代肝細胞蛋白酶體活性的影響，實驗結果顯示，IL-1 能提高蛋白酶體的糜蛋白樣（chymotrypsin-like，CT-L）活性。另外，IL-1 能夠誘導蛋白酶體重要的蛋白水解亞單位 LMP2 的表達，從而從蛋白酶體途徑揭示了炎性細胞因子降低 CYP2B1 活性的機制[20]。

5 展望

CYP2B6 是人類 CYP2B 亞家族的重要成員，近年來發(fā)現(xiàn)，盡管 CYP2B6 只占 CYP450 的 3%～5%，但它卻介導了許多臨床藥物的代謝。和其他 CYP450 一樣，CYP2B6 的活性和表達，除了受基因多態(tài)性控制外，特殊的病理狀態(tài)，如感染和炎癥也會對其產生顯著的影響，導致其對許多臨床藥物如抗腫瘤藥、抗 HIV 感染的非核苷類反轉錄酶抑制劑和抗抑郁藥等的代謝發(fā)生重大改變。因此，研究炎癥對 CYP2B6 活性的影響，對臨床合理、安全使用CYP2B6 底物藥物具有非常重要的意義。目前許多研究證實，炎癥狀態(tài)可以從轉錄后調節(jié)水平顯著降低 CYP2B6 的活性，這一改變機制涉及 NO 生成、蛋白質修飾等多種因素。進一步高度關注和持續(xù)研究炎癥狀態(tài)對 CYP2B6 活性的作用及機制，將為臨床病理狀態(tài)下 CYP2B6 底物藥物的正確使用提供有價值的理論和實驗依據(jù)。

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