王彧杰 王媛媛 王 蓉 原永芳

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院藥劑科，上海 201999

二甲亞砜對細(xì)胞色素P450酶3A4和2C9的影響

王彧杰 王媛媛 王 蓉 原永芳

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院藥劑科，上海 201999

目的 研究0.01%、0.05%、0.1%二甲亞砜（DMSO）對細(xì)胞色素P450（CYP450）酶系中 3A4、2C9兩個(gè)亞型基因及蛋白表達(dá)水平的影響。 方法Chang肝臟細(xì)胞經(jīng)處理后，分為空白對照組（僅含培養(yǎng)液）、DMSO組（分別采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO 處理）、睪酮組（分別采用 1、10、100 μmol/L 睪酮處理）、利福平組（分別采用 1、10、100μmol/L利福平處理）、DMSO+睪酮組（分別采用 0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10 μmol/L 睪酮處理）、DMSO+利福平組（分別采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10μmol/L利福平處理）。利用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法，測定CYP3A4、CYP2C9基因水平的表達(dá)。利用蛋白免疫印跡法，測定CYP3A4、CYP2C9蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果0.1%DMSO組CYP3A4mRNA高于空白對照組 （P＜0.01），且0.1%DMSO組CYP3A4蛋白的表達(dá)也高于空白對照組。0.01%、0.05%DMSO組CYP3A4mRNA表達(dá)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但0.01%、0.05%DMSO組CYP3A4蛋白的表達(dá)高于空白對照組。0.01%、0.05%、0.1%DMSO組CYP2C9mRNA表達(dá)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），0.01%、0.05%、0.1%DMSO組CYP2C9蛋白表達(dá)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。0.01%、0.05%DMSO+10μmol/L睪酮組CYP3A4mRNA的表達(dá)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），但 0.01%、0.05%DMSO+10μmol/L睪酮組 CYP3A4蛋白的表達(dá)高于睪酮組。0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10μmol/L利福平組CYP2C9 mRNA的表達(dá)與利福平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但0.01%、0.05%、0.1%DMSO+10μmol/L利福平組CYP2C9蛋白的表達(dá)高于利福平組。 結(jié)論 0.01%、0.05%、0.1%三個(gè)濃度的DMSO在體外肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對CYP3A4的表達(dá)有一定的影響，而對CYP2C9的表達(dá)影響不明顯，當(dāng)DMSO作為藥物溶劑的時(shí)候，可能會影響藥物單用時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

二甲亞砜；細(xì)胞色素P450酶3A4；細(xì)胞色素P450酶2C9；藥物代謝；相互作用

在藥物肝臟代謝中，細(xì)胞色素P450酶（CYP450）是與相關(guān)底物結(jié)合后活化或消除的重要藥物代謝酶。其中CYP3A4含量最高，約占30%；CYP2C9約占12.8%，是主要的藥物代謝酶[1]。150多種藥物可以通過CYP3A4或CYP2C9介導(dǎo)代謝，包括激素、免疫抑制劑、鈣離子通道阻滯劑、非甾體抗炎藥、抗菌藥物等。因此，研究藥物對CYP3A4、CYP2C9表達(dá)的影響非常重要?，F(xiàn)在許多研究常選用肝臟細(xì)胞研究藥物對CYP450酶的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，二甲亞砜（DMSO）是一種常用的藥物溶劑。因其具有一個(gè)親水的亞硫酰基和兩個(gè)疏水的甲基，所以DMSO既可溶解極性化合物也可溶解非極性化合物，可提高許多藥物的溶解度而在實(shí)驗(yàn)中被廣泛使用。通常認(rèn)為低濃度DMSO對細(xì)胞無毒性，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而，近年來的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)1%濃度的DMSO會影響干細(xì)胞的分化[2]；0.5%的DMSO影響耳蝸器官培養(yǎng)[3]；0.01%的DMSO抑制肝微粒體中P450 1A2的體外檢測[4]。此外，DMSO對CYP450酶也有影響：瑞士學(xué)者發(fā)現(xiàn)DMSO可上調(diào)HepaRG細(xì)胞中 CYP1A2、2B6、2C9和 3A4的表達(dá)[5]。但日本學(xué)者曾報(bào)道DMSO可抑制CYP2C9、CYP2C18基因的表達(dá)[6]。因此，本研究將考察不同濃度DMSO對肝細(xì)胞中CYP3A4和2C9表達(dá)的影響，以助于選擇合理的DMSO濃度用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，降低DMSO作為溶劑對體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Chang Liver細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO公司），胎牛血清（天杭生物科技有限公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），青-鏈霉素（Millpore公司），睪酮（Sigma 公司），利福平（Sigma 公司），RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司），苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），CYP3A4抗體（Chemicon公司），CYP2C9抗體（Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體IgG（鼎國生物技術(shù)有限公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠抗體IgG（威奧生物技術(shù)有限公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（GAPDH，Bioworld 公司），預(yù)染蛋白 Marker（Thermo 公司），DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（Milipore公司），Trizol（Invitrogen 公司），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），SYBR-標(biāo)記定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），100bp DNA ladder（鼎國昌盛生物有限公司）。

恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國Thermol公司），超微量分光光度儀（美國NanoDrop公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-RAD公司），Veriti?PCR熱循環(huán)儀 （美國Life Technologies公司），7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Life Technologies公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（法國Vilber公司），蛋白電泳轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-RAD公司），低溫高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Chang Liver細(xì)胞在含有 10% 胎牛血清（FBS）、1%青-鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液內(nèi)，37°C，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長至70%～80%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)期生長細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物處理及分組

選擇睪酮作為CYP3A4誘導(dǎo)劑，選擇利福平作為CYP2C9誘導(dǎo)劑，設(shè)定以下分組：空白對照組：細(xì)胞僅給予RPMI1640培養(yǎng)液；DMSO處理組（分別采用0.01%、0.05%、0.1%DMSO處理）；睪酮處理組（分別采用1、10、100μmol/L睪酮處理），利福平處理組（分別采用1、10、100 μmol/L 利福平處理）。（0.01%、0.05%、0.1%）DMSO+10μmol/L 睪酮組，（0.01%、0.05%、0.1%）DMSO+10μmol/L利福平組。每組各3個(gè)樣品。

1.4 定量PCR法檢測CYP3A4、CYP2C9mRNA表達(dá)

Chang Liver細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種密度1×106/mL，在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁生長至70%～80%時(shí)，加入上述不同藥物處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后，加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度及A260/A280值，當(dāng)A260/A280＞1.8時(shí)，證明純度較高。根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為RT-PCR的反應(yīng)模板，根據(jù)TaKaRa定量PCR試劑盒說明書，配制反應(yīng)液進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 30 s，PCR 反應(yīng) 95℃ 5 s，60℃34 s，循環(huán)數(shù)為40次，測定融解曲線，通過Ct值計(jì)算相對表達(dá)量[7]。以GAPDH為內(nèi)參，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參照，所有基因表達(dá)都以GAPDH作均一化處理。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 W estern blot方法檢測蛋白表達(dá)

細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，分別加入不同的藥物處理24 h后，用PBS清洗細(xì)胞3次，使用含有PMSF的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，操作均在冰上進(jìn)行，收集各組細(xì)胞裂解產(chǎn)物，加入1/4體積的上樣緩沖液，渦旋混勻，在100°C水浴中煮沸10min使蛋白變性。配制5%濃縮膠、10%分離膠，根據(jù)蛋白濃度決定加樣量。濃縮膠用電壓100 V電泳，當(dāng)樣品濃縮為一條直線改用150 V電壓，約70 min后停止電泳。取下凝膠100 V轉(zhuǎn)膜120min，TBST室溫封閉2 h。加入一抗，CYP3A4（1∶2000）、CYP2C9（1∶2000），GAPDH （1∶5000），4℃ 搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入1∶2000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；化學(xué)發(fā)光試劑顯色發(fā)光，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)都以GAPDH作均一化處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析。定量PCR中所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。分析前均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMSO對CYP3A4、CYP2C9mRNA表達(dá)的影響

定量PCR獲得的樣品Ct值，經(jīng)倍數(shù)轉(zhuǎn)換后，與空白對照組（1.00±0.06）比較，0.01%、0.05%的 DMSO[（1.00±0.18）、（1.24±0.11）]對 Chang 肝細(xì)胞中 CYP3A4 mRNA的表達(dá)幾乎沒有影響，而與空白對照組比較，0.1%的 DMSO（4.03±1.03）可明顯誘導(dǎo) CYP3A4mRNA的表達(dá)（P＜0.01）。見圖 1。

圖1 不同濃度二甲亞砜對CYP3A4 m RNA的影響

以同樣的方法測定不同濃度DMSO對CYP2C9 mRNA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組（1.05±0.39）比較，0.01%、0.05%、0.1%的 DMSO[（1.29±0.25）、（1.12±0.43）、（1.83±1.03）]對 Chang 肝細(xì)胞中 CYP2C9mRNA的表達(dá)幾乎沒有影響（P＞0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度二甲亞砜對CYP2C9 mRNA的影響

2.2 DMSO對CYP3A4、CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，0.01%、0.05%的 DMSO對Chang肝細(xì)胞中CYP3A4蛋白的表達(dá)幾乎沒有影響，而0.1%的DMSO可明顯誘導(dǎo)CYP3A4蛋白的表達(dá)。見圖3。

圖3 DMSO對CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，0.01%、0.05%、0.1%的DMSO對Chang肝細(xì)胞中CYP2C9蛋白的表達(dá)幾乎沒有影響。見圖4。

圖4 DMSO對CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

2.3 DMSO與藥物聯(lián)合使用對 CYP3A4、CYP2C9 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組（1.03±0.33）比較，0.01%、0.05%、0.1%的 DMSO＋10 μmol/L 睪酮組[（1.65±0.32）、（0.64±0.24）、（1.28±0.27）]Chang 肝細(xì)胞 CYP3A4 mRNA 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，10、100 μmol/L 的睪酮[（3.20±0.23）、（2.13±0.03）]能夠顯著上調(diào)CYP3A4mRNA的表達(dá)（P＜0.01）。見圖5。

圖5 二甲亞砜與睪酮聯(lián)合使用對CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組（1.02±0.29）比較，1、10、100 μmol/L的利福平[（0.93±0.11）、（1.30±0.76）、（1.02±0.15）]，以及 0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋利福平組[（0.70±0.17）、（2.77±1.63）、（0.88±0.53）]Chang 肝細(xì)胞 CYP2C9mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與10μmol/L利福平比較組，0.01%、0.05%、0.1%DMSO＋利福平組Chang肝細(xì)胞CYP2C9 mRNA的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 見圖 6。

圖6 二甲亞砜與利福平聯(lián)合使用對CYP2C9 m RNA表達(dá)的影響

2.4 DMSO與藥物聯(lián)合使用對CYP3A4、CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，單用睪酮可誘導(dǎo)Chang肝細(xì)胞CYP3A4蛋白的表達(dá)。但當(dāng)睪酮中分別加入0.01%、0.05%DMSO可使CYP3A4的蛋白表達(dá)顯著上升。見圖7。

圖7 DMSO與睪酮聯(lián)合使用對CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，單用利福平對Chang肝細(xì)胞CYP2C9蛋白的表達(dá)的影響較小，但當(dāng)利福平中分別加入0.01%、0.05%、0.1%DMSO均使CYP2C9的蛋白表達(dá)顯著上升，見圖8。

圖8 DMSO與利福平聯(lián)合使用對CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

3 討論

DMSO是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的藥物溶劑，常用的濃度為0.1%，普遍認(rèn)為該濃度下的DMSO對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響小。然而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)0.1%甚至更低濃度DMSO能夠影響Chang肝細(xì)胞中CYP3A4和CYP2C9的表達(dá)。以往研究也發(fā)現(xiàn)2.5%的DMSO可提高人肝臟細(xì)胞CYP3A4 mRNA的表達(dá)[8]。DMSO可通過以下途徑對CYP3A4 mRNA誘導(dǎo)性表達(dá)和構(gòu)成性表達(dá)產(chǎn)生影響：DMSO可增強(qiáng)CYP3A4mRNA啟動(dòng)子——孕烷活化受體（PXR）的表達(dá)[9]，從而增強(qiáng)其誘導(dǎo)性表達(dá)。增強(qiáng)其構(gòu)成性表達(dá)是通過激活激活蛋白（activator protein，AP-1）[10]，進(jìn)一步激活構(gòu)成性肝增強(qiáng)子模塊4（CLEM4）；并且促進(jìn)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）修復(fù)[9]，而增強(qiáng)其調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了0.1%DMSO可使肝臟細(xì)胞CYP3A4 mRNA和蛋白的表達(dá)升高。

但是本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DMSO在與睪酮聯(lián)合使用時(shí)，在基因水平上未見其上調(diào)CYP3A4mRNA作用，這可能是由于DMSO抑制了6β羥化睪酮的活化，從而抑制了CYP3A4mRNA的表達(dá)。而在蛋白水平上DMSO與睪酮聯(lián)合使用后可提高CYP3A4蛋白的表達(dá)。其原因可能是DMSO抑制了CYP3A4蛋白的代謝，也可能是DMSO增加了細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)睪酮的濃度升高，從而誘導(dǎo)了CYP3A4的蛋白表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，0.01%、0.05%、0.1%DMSO對CYP2C9 mRNA和蛋白的影響相對較小。CYP2C9轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到5'端啟動(dòng)子區(qū)孕烷活化受體（PXR）[11]、構(gòu)成性雄烷受體（CAR）[12]、維生素 D 受體（VDR）[13]、糖皮質(zhì)激素受體（GR）[14]等的識別，而核肝因子 4（HNF4）[15]、核肝因子3γ（HNF3γ）[16]參與 CYP2C9 的轉(zhuǎn)錄。 只有當(dāng)藥物反應(yīng)性核受體、核肝因子、共激活因子等共同作用才能最大程度地激活CYP2C9基因[17]。然而DMSO除對PXR的影響可見于文獻(xiàn)報(bào)道外，對其他因子的影響均未見報(bào)道。因此僅對PXR的作用可能不足以啟動(dòng)CYP2C9的基因轉(zhuǎn)錄。從藥物合用結(jié)果來看，單用DMSO對肝細(xì)胞CYP2C9無顯著影響。然而當(dāng)合用利福平后，CYP2C9蛋白表達(dá)明顯升高，這可能與DMSO增加細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)藥物濃度提高有關(guān)。相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，0.01%、0.05%、0.1%三個(gè)濃度的DMSO在體外肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對CYP3A4的表達(dá)有一定的影響，而對CYP2C9的表達(dá)影響不明顯；當(dāng)DMSO作為藥物溶劑的時(shí)候，可能會影響藥物單用時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在進(jìn)行相關(guān)藥物代謝酶的研究時(shí)，應(yīng)考慮DMSO對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

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Effects of Dimethyl Sulfoxide on Cytochrome P450 3A4 and 2C9

WANGYujieWANGYuanyuanWANGRongYUANYongfang
Department of Pharmacy,the Third People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 201999,China

ObjectiveTo investigate effects of 0.01%,0.05%,0.1%dimethyl sulfoxide (DMSO)on expression of CYP3A4 and CYP2C9 mRNA and protein.M ethods Chang liver cells were divided into control group (dealed with RPMI-1640 singly),DMSOgroups(dealedwith 0.01%,0.05%,0.1%DMSO),testosteronegroups(dealed with 1,10,100μmol/L testosterone),rifampicin groups(dealed with 1,10,100μmol/L Rifampicin),DMSO+testosterone groups(0.01%,0.05%,0.1%DMSO+10μmol/L testosterone)and DMSO+rifampicin groups(dealed with 0.01%,0.05%,0.1%DMSO+10μmol/L Rifampicin).The expression of CYP3A4 and CYP2C9 mRNA were detected by RT-qPCR,and the expression of CYP3A4 and CYP2C9 protein were detected by Western blot.Results Compared with control group,the expression of CYP3A4mRNA and protein was increased by 0.1%DMSO (P＜0.01);the expression of CYP3A4 protein could be induced by 0.01%and 0.05%DMSO,but no statistically significant difference on CYP3A4mRNA (P＞0.05).Compared with control group,there was no statistically significant difference on the expression of CYP2C9 mRNA and protein in DMSO groups(P＞0.05).Compared with control group,there was no statistically significant difference on the expression of CYP3A4mRNA in DMSO+testosterone groups(P＞0.05).Compared with testosterone group,the expression of CYP3A4 protein was induced in 0.01%,0.05%,0.1%DMSO+testosterone group.Compared with rifampicin group,the expression of CYP2C9 protein was increased in 0.01%,0.05%,0.1%DMSO+Rifampicin group,but no statistically significant difference on CYP2C9 mRNA (P＞0.05).Conclusion The efficiency of 0.01%,0.05%and 0.1%DMSO is greater on CYP3A4 than CYP2C9 in vitro test.0.01%,0.05%,0.1%DMSO can influence expression of CYP3A4,but have poor effect on expression of CYP2C9 in vitro.DMSO as solvent can influence results of experiment.

Dimethyl Sulfoxide;CYP3A4;CYP2C9;Drugmetabolism;Drug interaction

原永芳，女，博士，主任藥師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事藥代動(dòng)力學(xué)以及藥物分子機(jī)制方面的研究。

R966

A

1673-7210（2014）12（c）-0004-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號81373375）。

2014-09-19 本文編輯：蘇 暢）