陳堅　劉杰

摘 要 葉酸在DNA的合成和復制中起著重要作用，原有研究提示補充葉酸可以降低罹患結、直腸癌的風險，但近年來的研究對此提出了異議。本文通過相關文獻復習發(fā)現(xiàn)，補充葉酸雖可在人體未形成結、直腸癌之前通過提高DNA甲基化的穩(wěn)定性而產(chǎn)生預防腫瘤的作用，但當腸道內已形成腫瘤微小病灶后，補充葉酸反能產(chǎn)生促進腫瘤生長的作用，這可能與葉酸會促進腫瘤細胞的增殖有關。此外，補充葉酸對預防結、直腸癌的有效性有時間和劑量依賴性。因此，在應用葉酸預防結、直腸癌前應常規(guī)使用結腸鏡進行腫瘤篩查，以排除早期微小腺瘤。有條件的還應進行紅細胞及乙狀結腸上皮內的葉酸濃度測定，以評估患者的葉酸水平并據(jù)此避免補充的葉酸劑量過大。葉酸水平與罹患結、直腸癌的關系仍有待學者們更深入研究的揭示。

關鍵詞 葉酸 DNA甲基化 結、直腸癌

中圖分類號：R730.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）01-0016-04

葉酸是一種存在于蔬菜中的水溶性B族維生素，在體內參與嘌呤和胸腺嘧啶的合成，在DNA的合成和復制中起著重要作用。原有研究提示，補充葉酸可以降低罹患結、直腸癌的風險，但近年來的研究對此提出了挑戰(zhàn)。本文就補充葉酸對結、直腸癌發(fā)生的雙面影響作一系統(tǒng)綜述。

1 葉酸的體內代謝

人體內的葉酸總量在5 ～ 6 mg間，但人體不能自己合成葉酸，只能從食物中攝取并加以吸收和利用。葉酸經(jīng)口服后在腸道（主要是十二指腸上部）幾乎完全被吸收，5 ～ 20 min后即見于血中，1 h后達最高血藥濃度。葉酸經(jīng)門靜脈進入肝臟貯存，在肝內二氫葉酸還原酶的作用下轉變?yōu)榫哂谢钚缘乃臍淙~酸。后者是體內“一碳單位”的轉運體，是DNA合成的主要原料。葉酸的血漿半衰期約為40 min，在體內主要被代謝為喋呤和對氨基苯甲酰谷氨酸，部分由膽汁排泄至腸道的葉酸可被重吸收利用，從而形成腸-肝循環(huán)。

2 葉酸與DNA甲基化

現(xiàn)已明確，DNA甲基化是基因調控的一種重要方式。真核細胞DNA中CpG序列的5位胞嘧啶堿基約90%是甲基化的，細胞分裂、復制的DNA子鏈必須經(jīng)適當?shù)募谆揎?，否則其遺傳穩(wěn)定性將下降，導致染色體脆性提高、易斷裂。人類許多惡性腫瘤形成前往往先出現(xiàn)甲基化異常，總基因組和（或）特定基因的低甲基化會引致癌基因表達和抑癌基因變異或下調。因此，低葉酸水平可通過影響DNA的合成、修復及其甲基化狀態(tài)而影響基因的穩(wěn)定性及其調控，影響細胞的增殖與凋亡。DNA甲基化異常是人類腫瘤常見的特征性改變，總基因組DNA的低甲基化及某些基因啟動子區(qū)CpG島的高甲基化可能是葉酸缺乏會增加結、直腸癌發(fā)生的主要機制。啟動子區(qū)CpG島的高甲基化會抑制基因的翻譯和表達，而DNA低甲基化、特別是在啟動子區(qū)的低甲基化則能逆轉因甲基化所致癌基因的靜默。與正常組織相比，腫瘤組織總基因組的甲基化程度降低而抑癌基因啟動子區(qū)的甲基化程度卻增高，由此推斷葉酸是通過導致DNA甲基化異常而影響腫瘤發(fā)生的[1]。

亞甲基四氫葉酸還原酶是葉酸代謝過程中的關鍵酶，會將5，10-亞甲基四氫葉酸催化轉化為5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸通過提供甲基參與S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine， SAM）的合成，而SAM是體內生化反應、包括DNA甲基化反應的主要甲基供體。葉酸缺乏會導致SAM缺乏，引起基因組DNA低甲基化及抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化，從而容易發(fā)生腫瘤。同型半胱氨酸是蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，葉酸缺乏會引起S-腺苷同型半胱氨酸水平升高，由此抑制DNA甲基轉移酶的活性、引起DNA低甲基化[2]。有研究顯示，即使補充生理需要量的葉酸也可提高DNA甲基化水平[3]，這從反面證實了葉酸缺乏可導致DNA低甲基化。

由于葉酸在DNA甲基化及其合成和修復中起著重要作用、能維持基因的穩(wěn)定性，故如葉酸缺乏或代謝異常就可能引起腫瘤的發(fā)生，特別是在代謝旺盛、增殖迅速的組織（如結腸和直腸黏膜）中。DNA甲基化在基因表達調控中具有重要作用，葉酸可為DNA甲基化提供甲基。DNA甲基化異常會使抑癌基因失活、癌基因表達增加以及細胞異常增殖和分化不成熟，特別是在細胞更新速度快的腸道，故其與結、直腸癌的發(fā)生關系密切。

局部葉酸缺乏已在結腸癌患者中得到證實[4]。因此，對高危人群，有學者建議補充葉酸。但是，因血葉酸值和腸上皮葉酸值間的關系還不清楚，故鑒別局部葉酸缺乏的高危人群比較困難。為從內窺鏡獲取的少量活組織檢查標本中提取出結腸上皮細胞，出現(xiàn)了改進的離子螯合法。這種方法不同于酶消化法，可純化得到大量結腸上皮細胞而無血細胞污染。Meenan等[5]測試了使用離子螯合法獲得的結腸上皮的葉酸含量，發(fā)現(xiàn)在同一患者中，盲腸的葉酸含量較低，而十二指腸的葉酸含量可反映乙狀結腸的葉酸含量。乙狀結腸細胞標本的葉酸含量在保存時間超過1 ～ 3周的情況下仍然穩(wěn)定，血清葉酸值和紅細胞葉酸值與乙狀結腸上皮細胞的葉酸含量并不相關。此研究結果提示，乙狀結腸細胞標本的葉酸含量穩(wěn)定。雖然人體不同部位的葉酸值有所變化，但還是可以找出結腸細胞葉酸含量的標準范圍以鑒別局部葉酸缺乏患者。

3 葉酸與結、直腸癌發(fā)生的關系

葉酸缺乏與多種腫瘤如胃癌、結腸癌、胰腺癌和食管癌等的發(fā)生有關，這與DNA甲基化不穩(wěn)定、從而誘導基因突變有關，故葉酸已作為一種能預防基因突變的藥物用于腫瘤的化學預防。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，對有結、直腸息肉病史的患者，長期的葉酸強化治療可能會促使未發(fā)現(xiàn)的癌前病變增殖并向惡性演變，安全性令人擔憂。為了衡量葉酸的保護效應與這種可能同時存在的負面效應，Luebeck等[6]設計了一種結、直腸癌形成的生物數(shù)學模型，將葉酸治療的持續(xù)時間以及對細胞的促增殖和抑突變效應作為變量、將腫瘤形成的風險作為應變量，結果發(fā)現(xiàn)葉酸添加組的結、直腸癌的預計發(fā)生率高于未添加組，除非在人早期（20歲以前）就添加葉酸。在老年人群中即使小劑量補充葉酸也可能有害。葉酸的雙面效應與補充葉酸的劑量及時機密切相關。當然，這種結論還需要在動物模型及臨床上加以驗證。

由于在北美地區(qū)補充葉酸是強制措施、應用廣泛，故其會否促進結、直腸的癌前病變發(fā)展為惡性腫瘤是一個重大的公共衛(wèi)生課題。鑒于變異的腸隱窩（aberrant crypt foci， ACF）是最早的結、直腸癌的癌前病變表現(xiàn)，有學者在動物模型上觀察了補充葉酸對ACF的影響[7]。152只雄性SD大鼠斷奶后即被在其飲食中添加葉酸2 mg/kg，同時用化學物質azoxymethane誘導ACF。ACF誘導成功后6周，將大鼠隨機分組并分別在其食物中添加0、2、5或8 mg/kg的葉酸。待鼠齡34周后處死大鼠，觀察其結、直腸新生物的發(fā)生率、血漿葉酸和同型半胱氨酸（一種敏感的與組織葉酸水平負相關的指標）水平以及直腸上皮的增殖度。盡管ACF的數(shù)目隨著在飲食中所添加葉酸量的增加而上升（P=0.015），但4組結、直腸新生物的發(fā)生率并無顯著差別。然而，多發(fā)性腫瘤（≥3個）的發(fā)生率卻與飲食中的葉酸量呈正相關關系（r=0.32， P=0.002），與血漿同型半胱氨酸水平呈負相關關系（r=20.32， P=0.005）；腫瘤負荷與飲食中的葉酸量呈正相關關系（r=0.35， P=0.001），與血漿葉酸水平也呈正相關關系（r=0.33， P=0.008），與血漿同型半胱氨酸水平呈負相關關系（r=20.42， P<0.001）；結腸上皮增殖度與飲食中的葉酸量和血漿葉酸水平均呈正相關關系，與血漿同型半胱氨酸水平呈負相關關系。這些數(shù)據(jù)提示，長期補充葉酸可以促進ACF向結、直腸癌演變。

動物實驗證實，在早期新生物形成前補充葉酸可降低致癌風險，但在癌前病變形成后補充葉酸卻會促進腫瘤增殖。流行病學證據(jù)同樣證實，補充的葉酸劑量過高不僅無益，而且還會增加患癌風險。美國學者Cole等[8]對在1994-2004年間來自9個臨床中心的1 021例結、直腸腺瘤患者進行了一項Ⅲ期隨機、雙盲、對照臨床試驗。受試者按1∶1分成兩組，分別接受葉酸1 mg/d（n=516）或安慰劑（n=505）治療，同時再隨機服用阿司匹林（81或325 mg/d）或安慰劑。3年和5年后進行結腸鏡檢查隨訪，初步的觀察結果為新發(fā)結、直腸腺瘤（≥1個）的發(fā)生率及腺瘤的頻度（0、1 ～ 2或≥3個），進一步的觀察結果是嚴重病灶（≥25%絨毛成分、高度不典型增生、直徑≥1 cm或浸潤性癌）的發(fā)生率。在前3年里，有987例受試者（96.7%）接受了結腸鏡檢查隨訪，發(fā)現(xiàn)葉酸組的腺瘤發(fā)生率為44.1%（n=221），而安慰劑組為42.4%（n=206）（RR=1.04， 95% CI： 0.90 ～ 1.20； P=0.58）；嚴重病灶的發(fā)生率在葉酸組和安慰劑組分別為11.4%（n=57）和8.6%（n=42）（RR=1.32， 95% CI： 0.90 ～ 1.92； P=0.15）。有607例受試者（59.5%）接受了第2次結腸鏡檢查隨訪，發(fā)現(xiàn)葉酸組的腺瘤發(fā)生率為41.9%（n=127），而安慰劑組為37.2%（n=113）（RR=1.13， 95% CI： 0.93 ～ 1.37； P=0.23）；嚴重病灶的發(fā)生率在葉酸組和安慰劑組分別為11.6%（n=35）和6.9%（n=21）（RR=1.67， 95% CI： 1.00 ～ 2.80； P=0.05）。該研究結論是，補充葉酸會增加多發(fā)腺瘤的風險，但與年齡、性別、吸煙、酒精攝入、體重指數(shù)、基礎葉酸水平或服用阿司匹林無關。補充1 mg/d的葉酸不僅不能減少罹患結、直腸腺瘤的風險，且反而會增加患者發(fā)生嚴重病灶和多發(fā)腺瘤（≥3個）的風險。這是第一個有關補充葉酸不能預防結、直腸癌發(fā)生的隨機、對照臨床試驗報告。

美國安德森癌癥中心的Wallace等[9]研究發(fā)現(xiàn)，人血細胞中的葉酸水平過高會促進DNA過度甲基化、從而引起兩個重要的抑癌基因功能失活。研究人員統(tǒng)計了781例志愿者的生活方式和飲食信息，并比較了兩個抑癌基因ERα、SFRP1的甲基化水平。研究證實，隨著年齡增高，ERα和SFRP1的甲基化水平也相應提高，但不同種族人間以及直腸與結腸間的甲基化水平都存在差異。紅細胞中葉酸水平較高和較低患者間的ERα和SFRP1的甲基化水平有顯著差異?；颊唧w內紅細胞中的葉酸水平高度反映了患者長期的葉酸攝入量。研究結果顯示，長期過量攝入葉酸將引起DNA過度甲基化，從而可能導致癌癥以及一些衰老性疾病的發(fā)病幾率提高。這一研究結果打破了傳統(tǒng)的“葉酸無毒性”的觀念，將促使人們更加注意補充葉酸的正常攝入量。

葉酸廣泛存在于葉類蔬菜、水果和豆類等食品中。從1998年開始，美國FDA規(guī)定須在市場上銷售的面包、谷物、面粉、面條、大米和其他谷物產(chǎn)品中添加葉酸。此外，葉酸還被營養(yǎng)學家們推薦作為一種膳食補充劑。對健康成年男性和女性，推薦的葉酸日攝入量為400 μg；但對妊娠期婦女，推薦每日攝入800 μg的葉酸。不過，目前關于葉酸補充量規(guī)定的依據(jù)非常不充分。一項加拿大流行病學研究顯示，僅有不足1%的加拿大人葉酸缺乏（紅細胞中葉酸水平<305 nmol/L），而40%的加拿大人則葉酸水平過高（紅細胞中葉酸水平>1 360 nmol/L）；在育齡期婦女中，僅有22%葉酸水平低于需要預防胎兒神經(jīng)管缺陷的推薦值（<906 nmol/L）[10]。該研究認為，對加拿大人群憂患的不是葉酸缺乏而是葉酸水平過高。

Fife等[11]于2008年在《MEDLINE》、《EMBASE》、《Cochrane》和《CINAHL》數(shù)據(jù)庫中選擇符合隨機、對照臨床試驗要求的有關補充葉酸與結、直腸癌化學預防的英文論著進行薈萃分析?？傮w而言，接受補充葉酸治療3年內的患者發(fā)生結腸腺瘤的風險并未增加（OR=1.09， 95% CI： 0.93 ～ 1.28），但接受補充葉酸治療3年以上患者的結腸腺瘤發(fā)生率有所上升（OR=1.35， 95% CI： 1.06 ～ 1.70）；補充葉酸治療組發(fā)生嚴重病灶的風險明顯上升（OR=1.50， 95% CI： 1.06 ～ 2.10）。納入分析的數(shù)據(jù)沒有明顯的異質性。這項薈萃分析結果否定了葉酸水平與結、直腸癌發(fā)生呈負相關關系的傳統(tǒng)認識。

但目前的隨機、對照臨床試驗結果同樣不一致。為了進一步闡明葉酸水平與結、直腸癌發(fā)生的相關性，有學者在衛(wèi)生專業(yè)醫(yī)護人員中進行了兩項大樣本的前瞻性、隨機、雙盲、對照研究，即“衛(wèi)生專業(yè)人員隨訪研究（Health Professionals Follow-Up Study）”[8]和“護士健康研究（Nurses Health Study）”[12]。受試者在接受血漿葉酸基礎水平測定后被隨機分為兩組，分別接受葉酸1 mg/d（n=338）或安慰劑（n=334）治療并隨訪3 ～ 6.5年。隨訪的初步終點為任何新發(fā)生的結、直腸腺瘤（1996年5月-2004年3月），進一步的統(tǒng)計指標為新發(fā)生腺瘤的部位、分期及數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，兩組的總腺瘤發(fā)生率（≥1個）沒有顯著差別（RR=0.82， 95% CI： 0.59 ～ 1.13； P=0.22）。葉酸基礎水平較低（<7.5 ng/ml）的受試者補充葉酸后的腺瘤發(fā)生率明顯降低（RR=0.61， 95% CI： 0.42 ～ 0.90； P=0.01），但對葉酸基礎水平較高（>7.5 ng/ml）的受試者補充葉酸并無明顯作用（RR=1.28， 95% CI： 0.82 ～ 1.99； P=0.27）。沒有證據(jù)表明補充葉酸會增加結、直腸嚴重病變或多發(fā)腺瘤的發(fā)生風險。

4 結語

補充葉酸對結、直腸癌發(fā)生呈現(xiàn)雙面作用[13-16]，即在人體未形成腫瘤前可通過提高DNA甲基化的穩(wěn)定性而產(chǎn)生預防腫瘤的作用，但當腸道內已形成腫瘤微小病灶后則反會產(chǎn)生促進腫瘤生長的作用，這可能與葉酸能促進腫瘤細胞增殖有關。此外，葉酸對預防結、直腸癌的有效性有時間和劑量依賴性[17]。應用葉酸預防結、直腸癌前要常規(guī)進行結腸鏡檢查篩查，排除早期微小腺瘤。對有條件的醫(yī)院，建議進行紅細胞及乙狀結腸上皮內的葉酸濃度測定以評估患者的葉酸水平，避免補充的葉酸劑量過大。葉酸水平與結、直腸癌發(fā)生的關系仍待學者們更深入研究的揭示。

參考文獻

[1] 朱舜時， Joel M， 施堯， 等. 葉酸對胃癌和其他胃腸道癌發(fā)生的干預作用——臨床試驗七年隨訪[J]. 胃腸病學， 2002， 7（2）： 73-77.

[2] Lee S， Hwang KS， Lee HJ， et al. Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in colorectal neoplasia [J]. Lab Invest， 2004， 84（7）： 884-893.

[3] Pufulete M， AI Ghnaniem R， Khushal A， et al. Effect of folic acid supplementation on genomic DNA methylation in patients with colorectal adenoma [J]. Gut， 2005， 54（5）： 468-653.

[4] Lindzon GM， Medline A， Sohn KJ， et al. Effect of folic acid supplementation on the progression of colorectal aberrant crypt foci [J]. Carcinogenesis， 2009， 30（9）： 1536-1543.

[5] Meenan J， OHallinan E， Lynch S， et al. Folate status of gastrointestinal epithelial cells is not predicted by serum and red cell folate values in replete subjects [J]. Gut， 1996， 38（3）： 410-413.

[6] Luebeck EG， Moolgavkar SH， Liu AY. et al. Does folic acid supplementation prevent or promote colorectal cancer？ Results from model-based predictions [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2008， 17（6）： 1360-1367.

[7] Sie KK， Medline A， van Weel J， et al. Effect of maternal and postweaning folic acid supplementation on colorectal cancer risk in the offspring [J]. Gut， 2011， 60（12）： 1687-1694.

[8] Cole BF， Baron JA， Sandler RS， et al. Folic acid for the prevention of colorectal adenomas： a randomized clinical trial [J]. JAMA， 2007， 297（21）： 2351-2359.

[9] Wallace K， Grau MV， Levine AJ， et al. Association between folate levels and CpG island hypermethylation in normal colorectal mucosa [J]. Cancer Prev Res （Phila）， 2010， 3（12）： 1552-1564.

[10] van Engeland M， Herman JG. Viewing the epigenetics of colorectal cancer through the window of folic acid effects [J]. Cancer Prev Res （Phila）， 2010， 3（12）： 1509-1512.

[11] Fife J， Raniga S， Hider PN， et al. Folic acid supplementation and colorectal cancer risk： a meta-analysis [J]. Colorectal Dis， 2011， 13（2）： 132-137.

[12] Choi SW， Mason JB. Folate status： effects on pathways of colorectal carcinogenesis [J]. J Nutr， 2002， 132（Suppl 8）： S2413-S2418.

[13] Kim YI. Folate and colorectal cancer： an evidence-based critical review [J]. Mol Nutr Food Res， 2007， 51（3）： 267-292.

[14] Ulrich CM. Folate and cancer prevention： a closer look at a complex picture [J]. Am J Clin Nutr， 2007， 86（2）： 271-273.

[15] Larsson SC， Giovannucci E， Wolk A. Folate intake， MTHFR polymorphisms， and risk of esophageal， gastric， and pancreatic cancer： a meta-analysis [J]. Gastroenterology， 2006， 131（4）： 1271-1283.

[16] Ulrich CM， Potter JD. Folate supplementation： too much of a good thing？ [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2006， 15（2）： 189-193.

[17] Stolzenberg-Solomon RZ， Chang SC， Leitzmann MF， et al. Folate intake， alcohol use， and postmenopausal breast cancer risk in the Prostate， Lung， Colorectal， and Ovarian Cancer Screening Trial [J]. Am J Clin Nutr， 2006， 83（4）： 895-904.

（收稿日期：2012-12-17）