紅曲霉產(chǎn)琥珀酸與酯化酶的變化規(guī)律

蔡穎慧，潘佩平，黃 瀟，蘇檳楠，王慕華

（1.山西省生物研究所，山西 太原 030006；2.山西省分析科學(xué)研究院，山西 太原 030006）

紅曲霉（Monascus purpureus Went），散囊菌目中的一屬子囊菌曲霉科真菌，可產(chǎn)生紅曲色素、糖化酶、酯化酶和蛋白酶等各種酶類，廣泛應(yīng)用于食品著色、釀酒、食品發(fā)酵[1-2]。1979年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)紅曲霉可產(chǎn)生Monacolin K，具有降膽固醇、降血壓的功能[3]。此外，紅曲霉還能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、抗氧化、麥角固醇等多種活性物質(zhì)[4-5]。近年來，不少研究致力于利用紅曲霉代謝產(chǎn)物來治療非酒精性脂肪性肝病及骨質(zhì)疏松等多種疾病[6]。

琥珀酸（succinic acid），學(xué)名為丁二酸，是一種理想的風(fēng)味增強(qiáng)劑，它的存在，可以減少酸味刺激感，入口而覺綿軟。琥珀酸是合成許多高附加值產(chǎn)品的重要前體物質(zhì)，在食品及化工行業(yè)廣泛應(yīng)用[7]，由于化學(xué)法制備琥珀酸會(huì)對環(huán)境造成污染，近年來利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸受到廣泛關(guān)注[8-9]。

實(shí)驗(yàn)室從老陳醋用大曲中分離到1株紅曲霉菌株Monascus purpureus M1，該菌株產(chǎn)酯化酶能力強(qiáng)。紅曲霉酯化酶具有強(qiáng)的催化已酸乙酯的能力，酯化酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物在釀酒中起著重要的增香作用[10]。但目前關(guān)于對紅曲霉產(chǎn)琥珀酸的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)將紅曲霉傳統(tǒng)功能與新的研究方面相結(jié)合，對Monascus purpureus M1產(chǎn)琥珀酸及酯化酶動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行跟蹤測定，尋找紅曲霉發(fā)酵積累琥珀酸與酯化酶的最佳條件，為進(jìn)一步研究實(shí)現(xiàn)琥珀酸和酯化酶的聯(lián)產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持，為紅曲霉在食品發(fā)酵進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

菌株：紅曲霉M1（Monascus purpureus M1），實(shí)驗(yàn)室分離自老陳醋用大曲。

琥珀酸（色譜純） 美國Supelco公司；其余試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40、蛋白胨15、MgSO4?7H2O 1、K2HPO4?3H2O 1.5、瓊脂20，pH值自然。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖50、蛋白胨15、MgSO4?7H2O 1、K2HPO4?3H2O 1.5，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖50、可溶性淀粉60、蛋白胨15、MgSO4?7H2O 1、K2HPO4?3H2O 1.5，pH值自然。以上培養(yǎng)基0.1 MPa、121℃濕熱滅菌20 min[11]。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450 型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；ZKSY-600智能恒溫水浴鍋 南京科爾儀器設(shè)備有限公司；1100系列高效液相色譜儀 美國惠普公司；JS-HS冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；PHS-3C型精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：以5 mL無菌水洗下斜面培養(yǎng)的菌體，制成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，取懸浮液5 mL接至裝液量為50 mL/250 mL三角瓶的種子培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩（180 r/min）培養(yǎng)2 d。

搖瓶培養(yǎng)：按10%接種量將培養(yǎng)好的種子液體，接至裝液量為50 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩（180 r/min）培養(yǎng)10 d。

1.4 菌體干質(zhì)量測定

每天取適量發(fā)酵液，經(jīng)恒重濾紙過濾，將濾紙連菌體在105℃烘至恒質(zhì)量，稱量，即可求得菌體干質(zhì)量[11]。

1.5 琥珀酸測定

將紅曲霉發(fā)酵液與菌絲體分離，取5 mL紅曲霉生長各階段發(fā)酵液，超濾離心（PES膜，10 kD）[12]除去菌體后，取1 mL 上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋即得到待測液。色譜條件：色譜分離柱：Eclipse XDB-C8（4.6 mm×150 mm，5 μm）；保護(hù)柱：HP hypersil ODS C18（2.1 mm×20 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.005 mol/L pH 2.5硫酸水溶液；流動(dòng)相流速：1 mL/min；檢測器：可變波長檢測器；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：室溫[13]。

1.6 酯化酶活力測定

將紅曲霉發(fā)酵液與菌絲體進(jìn)行分離，取5 mL 紅曲霉生長各階段發(fā)酵液，離心（10 000 r/min、10 min）除去菌體，取1 mL上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋即得到待測液。

取稀釋后的酶液0.5 mL，加入pH 6.0的磷酸緩沖液3.0 mL和2.5 mmol/L醋酸-α-萘酯0.1 mL，37℃保溫15 min，加入固蘭B鹽0.4 mL，37℃保溫10 min，以不加醋酸-α-萘酯空白管調(diào)零，立即在528 nm波長處測定光密度。酶活力定義：37℃、15 min水解醋酸-α-萘酯產(chǎn)生1 nmol α-萘酚所需的酶量，單位為U/mL[14]。

1.7 紅曲霉培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.7.1 接種量的影響

接種量設(shè)置為8%、10%、12%（接種量均為體積分?jǐn)?shù)，下同）。溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)9 d。

1.7.2 pH值的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值設(shè)置為2.5～7.5，溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)6 d。

1.7.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及發(fā)酵過程中的實(shí)際情況，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，擬定不同因素水平?？疾旖臃N量、pH值、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速對產(chǎn)琥珀酸量及酯化酶活力的影響，尋找紅曲霉發(fā)酵過程最佳組合，采用L9（34）正交試驗(yàn)。

1.7.4 菌形實(shí)驗(yàn)

將前培養(yǎng)過程中得到的不同形態(tài)（團(tuán)狀、絲狀、顆粒狀）的菌體以10%的接種量轉(zhuǎn)接到初始pH 6.5的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)6 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉生長曲線及琥珀酸含量變化規(guī)律

圖1 紅曲霉生長曲線及琥珀酸含量變化Fig.1 Growth curve of Monascus purpureus and changes in succinic acid production

由圖1可知，紅曲霉在3～6 d紅曲霉的生長比較快，在第6天菌體干質(zhì)量達(dá)到最大值3.24 g，之后菌體量就略微下降，說明紅曲霉從第6天開始進(jìn)入衰亡期。在紅曲霉生長第2天即有琥珀酸的出現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，琥珀酸含量逐漸增加，在紅曲霉生長的第5天左右即達(dá)到最大值3.62 g/L，之后琥珀酸含量明顯下降。

琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間體，霉菌中普遍存在丙酮酸羧化支路，代謝過程中琥珀酸脫氫酶活性減弱，琥珀酸積累，并且琥珀酸屬于小分子物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞膜外[15]。在本實(shí)驗(yàn)中琥珀酸質(zhì)量濃度先增后減，由此推測，琥珀酸的產(chǎn)生主要是作為紅曲霉三羧酸循環(huán)代謝途徑的中間產(chǎn)物[16]，它在不斷生成也在不斷消耗。

2.2 紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶變化規(guī)律

圖2 紅曲霉生長過程中琥珀酸含量及酯化酶活性的變化Fig.2 Changes in succinic acid and esterifying enzyme production during the growth of Monascus purpureus

由圖2可知，紅曲霉積累酯化酶與琥珀酸的最高峰并不在同一時(shí)期，琥珀酸在紅曲霉生長的第5天達(dá)到最大值，而酯化酶在紅曲霉的生長過程中不斷的積累。酯化酶在酶學(xué)上是解酯酶的統(tǒng)稱，包括脂肪酶和酯酶，同糖化酶一樣，也是紅曲霉產(chǎn)生的一種一級代謝產(chǎn)物[17]，酯化反應(yīng)中兩種酶的比例對酯的生成產(chǎn)生影響。紅曲霉酯化酶的代謝極為復(fù)雜，目前對其作用機(jī)理及代謝產(chǎn)物形成特點(diǎn)的報(bào)道甚少。

發(fā)酵第5天琥珀酸質(zhì)量濃度最高，為3.57 g/L，此時(shí)酯化酶活力為99.14 U/mL，隨后琥珀酸質(zhì)量濃度下降，而酯化酶不斷積累，總酶活力緩慢增加。發(fā)酵第6天，琥珀酸質(zhì)量濃度2.94 g/L ，而酯化酶活力為128.5 U/mL，發(fā)酵至第9天，可達(dá)143.65 U/mL。隨后琥珀質(zhì)量濃度下降較為明顯，而酯化酶活力增加緩慢。因而，為兼顧琥珀酸及酯化酶的產(chǎn)量，初步認(rèn)為，發(fā)酵至第6天為最佳積累期。

2.2.1 不同接種量時(shí)紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶變化規(guī)律

圖3 不同接種量下紅曲霉產(chǎn)琥珀酸變化規(guī)律Fig.3 Dynamics of succinic acid production with different inoculum size by Monascus purpureus

如圖3所示，接種量為12%時(shí)，紅曲霉產(chǎn)琥珀酸在第5天達(dá)到最高值3.68 g/L，但隨后迅速下降，當(dāng)接種量為10%和8%時(shí)，紅曲霉產(chǎn)琥珀酸最高峰均有所延遲，第6天達(dá)到最高峰，下降速度也較為緩慢，琥珀酸最高質(zhì)量濃度分別為3.59 g/L和2.95 g/L。

圖4 不同接種量下紅曲霉產(chǎn)酯化酶變化規(guī)律Fig.4 Dynamic changes in esterifying enzyme activities from Monascus purpureus with different inoculum sizes

如圖4所示，紅曲霉生長前期產(chǎn)酯化酶隨著接種量的增加而有所提高，隨著時(shí)間的增加，酯化酶積累速率有所下降，最終至紅曲霉生長第9天，總的積累量極為接近。接種量為12%、10%、8%時(shí)，發(fā)酵至第5天，酯化酶總活力分別為129.78、116.14、89.20 U/mL；發(fā)酵至第6天，酯化酶總活力分別為143.22、140.65、119.91 U/mL。

接種量小，菌體生長緩慢，發(fā)酵周期延長，菌體活力低，誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的酶少，琥珀酸及酯化酶產(chǎn)量小。接種量大，菌體生長旺，較快達(dá)到穩(wěn)定期，琥珀酸被菌體自身利用的速度加快，而且培養(yǎng)液黏度增加，影響后期產(chǎn)物積累?？偟膩砜?，琥珀酸質(zhì)量濃度在第5～6天變化不大，而酯化酶變化較大。綜合考慮，接種量10%、發(fā)酵第6天結(jié)束，可兼顧琥珀酸及酯化酶的積累。

2.2.2 pH值對紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶的影響

圖5 不同pH值條件下紅曲霉產(chǎn)琥珀酸含量及酯化酶活性變化Fig.5 Changes in succinic acid and esterifying enzyme production by Monascus purpureus at different initial pH values

發(fā)酵至第6天，測定培養(yǎng)基初始pH 2.5～7.5范圍內(nèi)紅曲霉產(chǎn)琥珀酸含量及酯化酶活力，結(jié)果如圖5所示。pH 2.5時(shí)，紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶活力都比較低，隨著pH值的升高，琥珀酸含量及酯化酶活力均提高。pH 6.5時(shí)，琥珀酸含量及酯化酶活力最高，分別為3.72 g/L和 143.62 U/mL。

很可能低pH值能夠抑制三羧酸循環(huán)中一些關(guān)鍵酶（順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶）的活性，從而抑制了三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物琥珀酸的積累降低[18]，同時(shí)也影響紅曲霉生長代謝，最終導(dǎo)致酯化酶產(chǎn)量降低，并且低pH值還會(huì)破壞酯化酶的活性。另外，低pH值也可能影響紅曲霉細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，低pH值還可以改變紅曲霉在液體培養(yǎng)中的菌體形態(tài)，促進(jìn)緊密菌團(tuán)的形成。

2.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Orthogonal array design with experimental results

表1結(jié)果表明，在幾個(gè)影響因子中，極差結(jié)果為A＞B＞C＞D，說明初始pH值為影響紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶的最主要因素，其次為接種量、溫度和轉(zhuǎn)速。正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即接種量10%、初始pH 6.5、溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。

2.2.4 菌體形態(tài)對紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶的影響

表2 不同形態(tài)菌體產(chǎn)琥珀酸及酯化酶的差異Table2 Comparison of the abilities of different forms of Monascus purpureus to produce succinic acid and esterifying enzymes

相比于團(tuán)狀、絲狀菌體，顆粒狀菌體發(fā)酵液表觀黏度較低，由表2可知，菌體呈顆粒狀的紅曲霉產(chǎn)琥珀酸及酯化酶的能力明顯高于絲狀及團(tuán)狀紅曲霉，顆粒狀菌體發(fā)酵狀態(tài)下，琥珀酸積累量達(dá)到3.79 g/L，酯化酶活力可達(dá)到152.36 U/mL。而團(tuán)狀紅曲霉30℃培養(yǎng)6 d后，琥珀酸的積累量僅為3.28 g/L，酯化酶活力僅達(dá)到117.72 U/mL。很多研究結(jié)果證明，在液體發(fā)酵過程中，絲狀真菌的形態(tài)對產(chǎn)物的生產(chǎn)有很大的影響，菌體形態(tài)可以直接或間接地影響發(fā)酵過程，如改變傳質(zhì)、傳氧或?qū)е缕渌恍┠壳叭圆磺宄脑颍罱K改變整個(gè)發(fā)酵的效果[19-21]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了紅曲霉Monascus purpureus M1發(fā)酵產(chǎn)琥珀和酯化酶的變化規(guī)律，并對不同時(shí)間、接種量、pH值及菌體狀態(tài)對紅曲霉聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和酯化酶影響進(jìn)行了分析。紅曲霉生長至第6天菌體干質(zhì)量達(dá)到最大，而琥珀酸在紅曲霉生長的第5天即達(dá)到最高質(zhì)量濃度，隨后琥珀酸含量呈下降明顯。因而，琥珀酸主要作為紅曲霉三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物存在。酯化酶是紅曲霉產(chǎn)生的一級代謝產(chǎn)物，在紅曲霉生長過程中不斷地積累。顆粒狀菌體便于琥珀酸及酯化酶的積累。正交試驗(yàn)進(jìn)一步表明，接種量為10%、初始pH 6.5、30℃、180 r/min發(fā)酵至第6天，可兼顧琥珀酸及酯化酶的積累。下一步將對Monascus purpureus M1聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和酯化酶進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，增加琥珀酸和酯化酶的生成，為綜合利用Monascus purpureus M1提供參考。

[1]童群義.紅曲霉產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2003,24(1): 163-167.

[2]FENG Yanli, SHAO Yanchun, CHEN Fusheng.Monascus pigments[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(6): 1421-1440.

[3]ENDO A.Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species[J].Journal of Antibiotics, 1979, 32(8): 852-854.

[4]HUANG C S, HU H H, TSAI Y M, et al.in vitro effects of Monascus purpureus on antioxidation activity during fermentation of Kinmen sorghum liquor waste[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2013, 115(4): 418-423.

[5]譚艾娟, 寧瑋霽, 劉愛英, 等.紅曲霉產(chǎn)麥角固醇液體發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2008, 29(9): 434-436.

[6]YANG C W, MOUSA S A.The effect of red yeast rice (Monascus purpureus) in dyslipidemia and other disorders[J].Complementary Therapies in Medicine, 2012, 20(6): 466-474.

[7]BEAUPREZ J J, de MEY M, SOETAERT W K.Microbial succinic acid production: natural versus metabolic engineered producers[J].Process Biochemistry, 2010, 45(7): 1103-1114.

[8]CHOTANI G, DODGE T, HSU A, et al.The commercial production of chemicals using pathway engineering[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 2000,1543(2): 434-455.

[9]張敏, 馬江鋒, 徐冰, 等.利用木薯淀粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的研究[J].中國釀造, 2011, 30(7): 29-32.

[10]陳帥, 鄭佳, 劉琨毅, 等.紅曲酯化酶促反應(yīng)及其代謝產(chǎn)物特征[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(2): 47-51.

[11]周建建, 蘇理, 趙雙枝, 等.采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基組分[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(23): 152-158.

[12]ZHANG Yunjian, LI Qiang, ZHANG Yuxiu, et al.Clarification of succinic acid fermentation broth by ultrafiltration in succinic acid biorefinery[J].Journal of Zhejiang University-Science B: Biomedicine &Biotechnology, 2012, 13(2): 103-110.

[13]白冬梅, 杜國民, 趙學(xué)明, 等.反相高效液相色譜法測定產(chǎn)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸[J].分析化學(xué), 2003, 31(12): 1496-1499.

[14]潘名志, 譚艾娟, 劉愛英, 等.紅曲霉產(chǎn)酯化酶液體培養(yǎng)基研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué), 2009, 28(1): 58-62.

[15]孫瑩.霉菌SH-24好氧發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸的初步研究[D].煙臺(tái): 煙臺(tái)大學(xué), 2007.

[16]張洪勛, 羅海峰, 莊緒亮.琥珀酸發(fā)酵研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2003, 30(5): 102-106.

[17]YOSHIZAKI Y, SUSUKI T, TAKAMINE K, et al.Characterization of glucoamylase and α-amylase from Monascus anka: enhanced production of α-amylase in red koji[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 110(6): 670-674.

[18]HULAY A K, LEMAN T.Vancomycin antibiotic production and TCA-glyoxalate pathways depending on the glucose concentration in Amycolatopsis orientalis[J].Enzyme Microbial Technology, 2006, 38:727-734.

[19]KIM Y M, SONG H G.Effect of fungal pellet morphology on enzyme activities involved in phthalate degradation[J].Journal of Microbiology, 2009, 47(4): 420-424.

[20]SUN Hong, AIDUN C K, EGERTSDOTTER U.Effects from shear stress on morphology and growth of early stages of Norway spruce somatic embryos[J].Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105(3):588-599.

[21]PAPAGIANNI M.Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelial proeesses[J].Biotechnology Advances, 2004, 22:189-259.