王 強(qiáng)，龍 潔，李貴節(jié)，王 存

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；2.重慶第二師范學(xué)院教務(wù)處，重慶 400067）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）的一年生蔓生草本植物，是一種重要的蔬菜作物，其富含氨基酸、維生素、胡蘿卜素、礦物質(zhì)、脂肪酸和色素等生物活性成分，并且鈉含量較低，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源[1-4]。中醫(yī)認(rèn)為，南瓜味苦、性寒，可消炎、止痛、強(qiáng)肝、助腎、降低血壓、為產(chǎn)婦催奶、補(bǔ)中益氣。國(guó)內(nèi)外研究表明[5-6]，南瓜對(duì)糖尿病、特別是Ⅱ型糖尿病具有顯著的療效，并可預(yù)防由糖尿病引起的腎病、肝病、高血脂和高血壓等疾病的發(fā)生，這使南瓜作為一種特效營(yíng)養(yǎng)保健食品備受人們的重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究表明南瓜中的活性多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平等功能[7-8]，已成為當(dāng)前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。此外，包曉瑋等[9]研究發(fā)現(xiàn)，南瓜多糖能提高小鼠免疫器官質(zhì)量、巨噬細(xì)胞的吞噬功能，揭示南瓜多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。王傳棟等[10]探討南瓜多糖體內(nèi)體外的抗腫瘤作用以及對(duì)紅細(xì)胞免疫功能的影響，結(jié)果顯示南瓜多糖可增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫吸附能力，具有一定的抗腫瘤及提高免疫活性的作用。

南瓜皮，作為南瓜深加工過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物，富含多糖和果膠等功能成分。我國(guó)每年利用的南瓜籽數(shù)千噸，但對(duì)南瓜皮資源的利用十分有限[11-13]。若將這些廢棄的南瓜皮作為生產(chǎn)多糖的原料，將會(huì)產(chǎn)生大量的優(yōu)質(zhì)南瓜皮粗多糖（pumpkin peel polysaccharides，PPPs）[14-16]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究PPPs對(duì)小鼠抗疲勞能力的影響，以豐富PPPs在提高機(jī)體抗疲勞能力方面的證據(jù)，為PPPs的抗疲勞研究及其相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜：新鮮，無(wú)病蟲(chóng)害，購(gòu)于市場(chǎng)；SPF級(jí)小鼠（許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0002）50 只，體質(zhì)量18～22 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)提供。

D-半乳糖 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）試劑盒、肝糖原（hepatic glycogen，HG）試劑盒、肌糖原（muscle glycogen，MG）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、血乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所用水為雙蒸水，所用其他溶液均自行配制。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；超聲波 寧波新芝生物科技有限責(zé)任公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ公司。

1.2 方法

1.2.1 PPPs的制備

選擇成熟的南瓜作為原料，將原料清洗、削皮；將南瓜皮干燥（65℃）至水分含量8%；粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩。用95%的乙醇40℃熱處理1 h，再重復(fù)1次，以除去單糖、低聚糖和色素等小分子物質(zhì)，同時(shí)滅酶活以防止在提取過(guò)程中多糖的降解。抽濾、濃縮、干燥，得到預(yù)處理原料。預(yù)處理后的南瓜皮粉于95℃熱水提取兩次（料液比為25∶1（m/V），2 h/次）→離心（3 000 r/min、10 min）→合并上清液→95%乙醇、100%乙醇、丙酮分別處理，4℃放置24 h→離心（3 000 r/min、10 min）→溶解，Sevag方法脫蛋白[17]（8次）→透析→冷凍干燥→PPPs。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條件和分組

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)條件為：溫度18～22℃、相對(duì)濕度45%～55%，自然光照，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)前將50只小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)分成5 組（雌雄各半，每組小鼠平均體質(zhì)量相差＜2 g），分別是正常對(duì)照組（CN）、衰老模型對(duì)照組（DC）、多糖低、中、高劑量組（PPPs-L、PPPs-M、PPPs-H）。CN組腹腔注射100 mg/（kg·d）生理鹽水，其余4 組腹腔注射100 mg/（kg·d）D-半乳糖，實(shí)驗(yàn)周期60 d。從實(shí)驗(yàn)第41天開(kāi)始，CN和DC組灌胃蒸餾水，多糖低、中和高劑量組腹腔注射D-半乳糖的同時(shí)灌胃125、250、500 mg/（kg·d）劑量的PPPs，連續(xù)給藥20 d。各組給予基礎(chǔ)飼料和自由飲水。

1.2.3 力竭游泳實(shí)驗(yàn)

末次給藥30 min后，給予小鼠尾部負(fù)重相當(dāng)于自重5%的鉛絲，將各組小鼠分別放入10個(gè)恒溫水池箱，水深（20±5） cm、水溫（25±1）℃，進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)。放入后立即計(jì)時(shí)，觀察小鼠游泳情況，并適時(shí)用玻璃棒撥動(dòng)小鼠使其始終處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。小鼠自開(kāi)始到沉于水面下8 s后不能浮出水面的時(shí)間作為力竭游泳時(shí)間（min）。

1.2.4 測(cè)試樣品的制備和檢測(cè)

力竭游泳實(shí)驗(yàn)后，斷頭取血致死，收集血液，4 000 r/min離心10 min，上清液備用。所有處理均在4℃條件下完成。

用BUN、BLA、HG、MG、MDA和SOD及LDH試劑盒結(jié)合紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s（n=10）表示，并進(jìn)行方差分析，LSD法多重比較，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPPs對(duì)衰老小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

疲勞是一種常見(jiàn)的生理現(xiàn)象，其過(guò)程為過(guò)度勞動(dòng)或運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體生理生化功能改變而導(dǎo)致機(jī)體勞動(dòng)或運(yùn)動(dòng)能力的暫時(shí)降低，實(shí)際上疲勞是防止機(jī)體發(fā)生機(jī)能衰竭而產(chǎn)生的一種保護(hù)性反應(yīng)。疲勞可以導(dǎo)致精神不振、注意力不集中、抵抗力下降等一系列后果，嚴(yán)重影響工作效率或運(yùn)動(dòng)成績(jī)，故研究延緩或消除疲勞的措施具有十分重要的意義[18-19]。

D-半乳糖衰老模型在國(guó)內(nèi)外被廣泛用于衰老機(jī)理研究和抗疲勞藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)[20]。PPPs對(duì)衰老小鼠游泳時(shí)間的影響見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組和不同多糖劑量組小鼠力竭游泳時(shí)間均高于衰老模型組，PPPs-L組與衰老模型對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），其余均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；并且衰老小鼠力竭游泳時(shí)間與多糖劑量成正相關(guān)，而且PPPs-M和PPPs-H組的小鼠力竭游泳時(shí)間均高于正常對(duì)照組，其中，PPPs-H組比正常對(duì)照組提高了21.6%（P＜0.05）。結(jié)果說(shuō)明南瓜皮多糖可顯著提高衰老小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，延緩疲勞的發(fā)生。

圖1 PPPs對(duì)衰老小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Fig.1 Effect of PPPs on exhaustive swimming time in aged mice

2.2 PPPs對(duì)衰老小鼠相關(guān)生理指標(biāo)的影響

能量物質(zhì)的消耗、代謝物質(zhì)的堆積是產(chǎn)生疲勞的重要原因[21]。常用的疲勞的評(píng)價(jià)方法主要有兩個(gè)：運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)的檢測(cè)。在反映疲勞的生化指標(biāo)中，血尿素氮（BUN）、血乳酸（BLA）和糖原等生化指標(biāo)的改變最具代表性，也是檢測(cè)疲勞最常用的指標(biāo)[22]。當(dāng)糖原被大量消耗時(shí)，機(jī)體活動(dòng)能力降低，從而導(dǎo)致全身性疲勞的發(fā)生。糖原貯備的提高有利于機(jī)體耐力速度的提高，并減少蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解代謝。

表1 PPPs對(duì)衰老小鼠的相關(guān)生理指標(biāo)影響Table1 Effect of PPs on physiological indexes in aged mice

由表1可知，不同多糖劑量組小鼠BUN和BLA含量均顯著低于衰老模型對(duì)照組（P＜0.05），PPPs低、中和高劑量組BUN含量分別比衰老模型對(duì)照組降低了10.3%、15.9%和23.9%，呈顯著差異（P＜0.05），并且PPPs中和高劑量組對(duì)BUN含量的降低效果與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；PPPs低、中、高劑量組BLA含量分別比衰老模型對(duì)照組降低了18.7%、22.4%、33.8%，呈顯著差異（P＜0.05），并且PPPs低、中、高劑量組對(duì)BLA含量的降低效果與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。由表1還可以看出，低、中、高3個(gè)劑量組的肝糖原和肌糖原含量均高于正常對(duì)照組；其中，與正常對(duì)照組相比，中、高劑量組肝糖原和肌糖原的含量均顯著性增加，說(shuō)明PPPs可以增加糖原的儲(chǔ)備，為機(jī)體提供能量，延緩疲勞產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體疲勞時(shí)，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的生化改變，包括糖原儲(chǔ)備量降低、血尿素氮和血乳酸水平升高等[21-22]。體內(nèi)的糖原是運(yùn)動(dòng)時(shí)能量的來(lái)源，糖原儲(chǔ)備充足，供應(yīng)的能量就多，抗疲勞能力就強(qiáng)。因此糖原的含量能說(shuō)明疲勞發(fā)生的快慢或程度，當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)細(xì)胞相對(duì)缺氧，糖酵解加快、產(chǎn)生大量乳酸，清除肌肉中過(guò)多的乳酸，可延緩和消除疲勞[23]。此外，機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，蛋白質(zhì)及氨基酸的分解代謝增強(qiáng)，氨基酸會(huì)代謝轉(zhuǎn)化生成尿素進(jìn)入血液，使血尿素含量增加，與血乳酸一樣，血尿素氮也是疲勞時(shí)肌肉酸痛的主要原因[19,24]。

表2 PPPs對(duì)衰老小鼠MDA含量、SOD及LDH活力的影響Table2 Effect of PPs on the contents of MDA, SOD and LDH in the blood of aged mice

表2顯示PPPs對(duì)衰老小鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化水平（丙二醛）和血清抗氧化狀態(tài)的影響，PPPs低、中和高劑量組與衰老模型對(duì)照組相比，血清MDA含量分別降低了10.3%、19.3%和27.7%，并且PPPs中和高劑量組對(duì)MDA含量的降低效果與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。與衰老模型對(duì)照組相比，PPPs低、中和高劑量組的血清SOD活性顯著提高（P＜0.05），PPPs高劑量組的血清SOD活性與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。表2中的結(jié)果還表明，與衰老模型對(duì)照組相比，PPPs低、中和高劑量組的血LDH活性顯著提高（P＜0.05），并且PPPs中、高劑量組的血LDH活性與正常對(duì)照組相比顯著提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPPs具有良好的體內(nèi)抗氧化活性，可顯著提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活力，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化防護(hù)能力，清除體內(nèi)氧自由基，防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，有效預(yù)防動(dòng)物細(xì)胞自由基損傷，可能是其具有抗疲勞作用的主要機(jī)制所在。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南瓜皮粗多糖具有良好的體內(nèi)抗氧化活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力，可顯著提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活力，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化防護(hù)能力，清除體內(nèi)氧自由基，防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，有效預(yù)防動(dòng)物細(xì)胞自由基損傷，可能是其具有抗疲勞作用的主要機(jī)制所在。

3 結(jié) 論

疲勞是由運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體一系列生化改變而導(dǎo)致的肌肉力量的降低。評(píng)價(jià)疲勞的方法包括耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)的檢測(cè)。通過(guò)小鼠耐力實(shí)驗(yàn)不難發(fā)現(xiàn)，PPPs-H高劑量組比正常對(duì)照組運(yùn)動(dòng)耐力時(shí)間延遲了21.6%（P＜0.05）。不僅如此，PPPs-H組還有效增加了衰老小鼠SOD及LDH活性，顯著降低小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后血尿素氮、血乳酸和MDA含量，顯示出PPPs-H具有延長(zhǎng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的作用。

此外，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體為維持血糖水平，肝糖原會(huì)下降，因此糖原含量也是檢測(cè)抗疲勞作用的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPPs高、中、低3個(gè)劑量組的肝糖原和肌糖原含量均高于正常對(duì)照組；其中，與正常對(duì)照組相比，PPPs中、高劑量組肝糖原和肌糖原的含量均顯著性增加（P＜0.05），說(shuō)明PPPs可以增加糖原的儲(chǔ)備，為肌體提供能量，延緩疲勞產(chǎn)生。盡管南瓜皮粗多糖能夠提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，顯著改善了脂質(zhì)過(guò)氧化水平和血清抗氧化狀態(tài)，但有關(guān)其具體的抗疲勞機(jī)理以及構(gòu)效關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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