張薇，羅亞琴

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南長沙410128；2.東方科技學院，湖南長沙410128）

栽培生理

利用聚酰胺樹脂分離純化馬鈴薯皮中的黃酮類物質

張薇1*，羅亞琴2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南長沙410128；2.東方科技學院，湖南長沙410128）

利用聚酰胺樹脂分離純化馬鈴薯皮中的總黃酮，通過靜態(tài)吸附試驗和動態(tài)吸附試驗研究了各因素對黃酮類物質的吸附及解吸附影響。結果表明，靜態(tài)洗脫過程中，調節(jié)pH值為6左右，溫度為30℃左右，振蕩4 h后靜置24 h，并采用濃度為70%乙醇作為洗脫液，即能獲得最佳工藝；采用20 g聚酰胺樹脂裝層析柱的動態(tài)洗脫過程中，徑高比為2.0/10.0（cm/cm），以70%乙醇作為洗脫液，即能獲得動態(tài)的最佳工藝。

馬鈴薯皮；黃酮；聚酰胺樹脂；分離純化

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科植物，馬鈴薯中的黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，具有抗A型流感病毒、消炎、抑制異常的毛細血管通透性增加及阻力下降、擴張冠狀動脈、增加冠狀流量、影響血壓、改變體內酶活性、改善微循環(huán)、解痙、抑菌、抗肝炎病毒和抗腫瘤等作用，有很高的藥用價值[1-6]。聚酰胺分離原理主要是靠吸附力，即聚酰胺中的酰氨基與化合物中的一些基團形成氫鍵而產(chǎn)生的吸附作用，由于各化合物結構不同，因而與聚酰胺形成氫鍵的能力不同，使化合物得以分離。聚酰胺柱層析法分離效果好，樣品容量大，適于在制備分離工藝中應用。用聚酰胺層析柱對各種黃酮苷類進行分離，效果較好。本研究對馬鈴薯塊莖中的黃酮類化合物進行提取，用聚酰胺樹脂分離純化馬鈴薯皮中總黃酮，進行效果的試驗研究，獲得該樹脂分離純化馬鈴薯皮中的黃酮的實驗參數(shù)，包括pH值、料液濃度、洗脫液組成、洗脫流速、柱徑高比等，以確定該樹脂分離純化馬鈴薯皮中黃酮的最佳條件。研究結果對馬鈴薯皮中黃酮的應用具有重要意義[7-9]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

蘆丁標準品AR（中國食品藥品檢定所），99.8%乙醇AR、亞硝酸鈉AR、硝酸鋁AR、氫氧化鈉AR（國藥集團化學試劑有限公司）,聚酰胺型號14-30目pH 6-7視比重小于0.25 g∕mL（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

蘆丁標準母液：準確稱取0.0253 g蘆丁標準品，用70%乙醇溶解，置于50 mL容量瓶中定容至刻度，得到濃度為0.0240 mg∕mL標準母液。

1.1.2 儀器

紫外分光光度計，UV-2450，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯皮中提取液的制備

將新鮮馬鈴薯洗凈，瀝干水分，切碎（保留皮部分），取10.0 g濕馬鈴薯皮，放入500 mL圓底燒瓶中，按1:20（w:v）的料液比添加酒精溶液（10 g馬鈴薯添加200 mL 70%的乙醇），使用微波提取法（微波時間10 min，微波功率400 W的條件下，產(chǎn)率最高）提取黃酮[9,10]，抽濾獲得提取液，并將濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮到一定體積定容作為待用液。

1.2.2 黃酮含量的測定

1.2.2.1 馬鈴薯皮黃酮含量的測定——NaNO2-Al (NO3)3-NaOH比色法

黃酮母核中含有堿性氧原子，一般又多帶酚羥基，能和Al3+產(chǎn)生黃色絡合物，加入NaNO2溶液和NaOH，在堿性溶液中呈紅色，溶液在一定波長處有最大吸收，顯色反應在60 min內穩(wěn)定。黃色的深淺與黃酮的含量呈一定的比例關系,可以用蘆丁為對照品，用Al(NO3)3作為顯色劑，因為吸光度與蘆丁的濃度呈線性關系，采用分光光度法對總黃酮進行含量測定[2]。

1.2.2.2 測定波長的確定

分別移取蘆丁標準母液0.00和10.00 mL于25.00 mL容量瓶中，分別加入1.00 mL 5%的NaNO2，搖勻后靜置6 min，然后再加入1.00 mL 10%的Al(NO3)3，搖勻后靜置6 min，加入10.00 mL 4%的NaOH，用70%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置15 min。以70%乙醇空白作參比，用UV-2450型紫外可見分光光度計在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，掃描最大吸收波長。

1.2.2.3 標準曲線的制備

分別準確移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00和6.00 mL濃度為0.0240 mg∕mL蘆丁標準母液至25.00 mL容量瓶中，參照1.2.2.2中方法處理，以70%乙醇空白作參比，用UV-2450型紫外分光光度計在最大吸收波長處測定吸光度Y，繪制標準曲線。

1.2.2.4 馬鈴薯皮黃酮含量測定

準確移取10.00 mL黃酮提取液至25.00 mL容量瓶中，按1.2.2.1中方法處理，測定其吸光度，并結合標準曲線計算含量。

1.2.3 聚酰胺樹脂的預處理

將聚酰胺樹脂用適量的濃度95%乙醇浸洗24 h，至浸洗液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時為止，再用水反復清洗干凈至無醇味，加入濃度為2 mol∕L的NaOH溶液浸泡12 h，以水洗至中性；再用濃度為4 mol∕L的HCl溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性后，在60℃下烘干備用。

按下式計算樹脂的吸附量Qe和吸附率q1：

式中：

C0——原液質量濃度(mg∕mL)；

C1——吸附液質量濃度(mg∕mL)；

V1——溶液體積(mL)；

M——干樹脂重(g)。

按下式計算樹脂的解析量Qd和解析率q2:

式中：

C0——原液質量濃度(mg∕mL)；

C1——吸附液質量濃度(mg∕mL)；

C2——解析液質量濃度(mg∕mL)；

V2——解析液體積(mL)。

1.2.4 靜態(tài)工藝條件考察

1.2.4.1 樹脂的飽和吸附量

稱取已處理好的聚酰胺樹脂1.0 g共5份，置于100 mL三角瓶中，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g∕mL）的比例分別加入馬鈴薯皮粗提液（黃酮含量為0.053 mg∕mL），然后振蕩吸附3 h，靜置24 h，使其達到飽和吸附，吸取上層液測定吸光度，以吸附率為評價指標，考察樹脂的飽和吸附量。

1.2.4.2 pH值對樹脂吸附率的影響

黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因此要找出吸附的最佳條件，即考察pH對樹脂吸附性能的影響。準確稱取已預處理好的聚酰胺樹脂1.0 g共8份，置于100 mL三角瓶中，各加入20.00 mL馬鈴薯皮粗提液（黃酮含量為0.128 mg∕mL），并分別調節(jié)pH分別為2，3，4，5，6，7，8和9（用HCl或NaOH溶液調節(jié)溶液的pH值），置于30℃水浴搖床中分別振蕩吸附3 h，振后靜置24 h，使其達到飽和吸附，吸取上層液測定吸光度，以吸附率為評價指標，考察pH對樹脂的吸附率的影響。

1.2.4.3 吸附時間對樹脂吸附率的影響

稱取已預處理好的聚酰胺樹脂1.0 g共5份，置于100 mL三角瓶中，分別加入20.00 mL馬鈴薯皮粗提液（黃酮含量為0.054 mg∕mL），置于30℃水浴搖床中分別振蕩1，2，3，4和5 h，振后靜置24 h，使其達到飽和吸附，吸取上層液測定吸光度，以吸附率為評價指標，考察不同吸附時間對樹脂的吸附量和吸附率的影響。

1.2.5 靜態(tài)解析工藝條件考察

1.2.5.1 乙醇濃度對樹脂解析率的影響

稱取已預處理好的聚酰胺樹脂1.0 g共8份，置于100 mL三角瓶中，分別加入20.00 mL馬鈴薯皮粗提液（黃酮含量0.053 mg∕mL），置于30℃水浴搖床中振蕩3 h，振后靜置24 h，使其達到飽和吸附，過濾溶液，分離樹脂，分別加入20.00 mL 60%，70%，80%，90%和95%乙醇溶液，置于30℃水浴搖床中振蕩2 h，過濾，測定濾液的吸光度，根據(jù)標準曲線得出濃度，考察不同乙醇濃度對樹脂解析率的影響。

1.2.5.2 解析時間對樹脂解析率的影響

稱取已預處理好的聚酰胺樹脂1.0 g共5份，置于100 mL三角瓶中，分別加入20.00 mL馬鈴薯皮粗提液（黃酮含量0.053 mg∕mL），置于30℃水浴搖床中振蕩2 h，振后靜置24 h，使其達到飽和吸附，過濾溶液，分離樹脂，加入20 mL 80%乙醇溶液，置于30℃水浴搖床中振蕩1，2，3，4和5 h，過濾，測定濾液的吸光度，根據(jù)標準曲線得出濃度，考察不同時間對樹脂解析率的影響。

1.2.6 動態(tài)工藝條件考察

1.2.6.1 徑高比對樹脂吸附率的影響

根據(jù)聚酰胺樹脂的吸附量和上樣量設定一系列柱高，稱取已處理好的聚酰胺樹脂5.0，10.0，15.0和20.0 g，用濕法裝柱，按徑高比分別為2.0∶2.9，2.0∶5.2，2.0∶7.7和2.0∶10.0于同一型號（2.0 cm× 20 cm）的柱子中，將馬鈴薯皮粗提液（黃酮含量0.128 mg∕mL）2.5 mL加去離子水稀釋至100 mL，以流速為2～3 mL∕min上樣，收集流出液，測定流出液的黃酮含量，計算樹脂吸附率。

1.2.6.2 洗脫液體積對損失率的影響

取已處理好的大孔吸附樹脂20.0 g共3份，濕法裝入層析柱中，將馬鈴薯皮黃酮粗提液2.5 mL稀釋至25 mL上樣，用25，50和75 mL去離子水沖洗，以流速2～3 mL∕min過柱，收集流出液，測流出液中黃酮含量，計算水洗體積對樣品損失率。

1.2.6.3 最佳條件下的洗脫曲線

用經(jīng)過預處理的聚酰胺樹脂裝入內徑為2.0 cm的層析柱，使柱高為10.0 cm，將濃縮提取液過柱，采用上述試驗確定的最佳參數(shù)即上樣濃度為0.184 mg∕mL，pH為3.0和6.0，上樣流速0.4 mL∕min，用70%的乙醇以0.4 mL∕min的流速洗脫。每5 min收集一管流出液，并且使用紫外分光光度計測定吸光度，并計算馬鈴薯皮黃酮濃度，以洗脫體積（mL）為橫坐標，馬鈴薯皮黃酮濃度(mg∕mL)為縱坐標，繪制洗脫曲線。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

按1.2.2.2試驗方法，以蒸餾水空白作參比，在300～800 nm波長范圍內，掃描測定其最大吸收波長。從掃描結果可知，蘆丁與顯色劑在503 nm處有較好的吸收峰，因此選取503 nm為最大吸收峰。

2.2 蘆丁標準曲線的繪制

在503 nm波長下，以蒸餾水空白為參比，以濃度（mg∕L）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線圖，得到線性回歸方程為：Y=10.27425X-0.04713，R2=0.9930，說明在濃度0.012～0.060 mg∕mL范圍內線性關系良好。

2.3 馬鈴薯皮黃酮含量測定

根據(jù)Y-X曲線方程和下列公式計算樣品濃度和黃酮提取率。

黃酮濃度X（mg∕L）=（Y+0.04713）∕10.27425×n式中：

Y——樣品的吸光值；

n——稀釋倍數(shù)。

馬鈴薯皮黃酮提取率（%）=X×V×10-6∕原料質量×100

式中：

X——黃酮濃度（mg∕L）)；

V——浸提液體積（mL）。

2.4 靜態(tài)吸附工藝條件研究

2.4.1 樹脂的飽和吸附量

按照1.2.4.1方法，考察樹脂的飽和吸附量，結果如圖1所示。

圖1 樹脂的飽和吸附量Figure 1Saturated adsorption capacity of resin

由圖1可知，樹脂的飽和吸附量在體積為20.00 mL時趨于穩(wěn)定，故選擇20.00 mL作為最佳吸附量。

2.4.2 pH對樹脂吸附率的影響

通過1.2.4.2 pH值對樹脂吸附率的影響的試驗，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，pH值對吸附量影響較大，隨著pH值的增加，吸附量也增加，當吸附液濃度pH在4～6左右時具有良好的吸附率，且粗提液的濃度pH值在5～6附近，所以吸附液無需調pH。但為了準確性，在吸附液濃度pH值為3左右時也進行了測定作對比。

2.4.3 吸附時間對樹脂吸附率的影響

按照1.2.4.3方法，考察不同吸附時間對樹脂吸附率的影響，結果如圖3所示。

由圖3可看出，隨著吸附時間增加吸附率也隨著增加，但是吸附時間達到4 h后，吸附率增加速率變得慢。進而，以4 h作為最佳吸附時間。

2.5 靜態(tài)解析工藝條件結果

2.5.1 乙醇濃度對樹脂解析率的影響

按照1.2.5.1方法考察不同濃度乙醇對樹脂解析率的影響，結果如圖4所示。

圖2 不同pH對樹脂吸附率的影響Figure 2Effect of pH on adsorption rate of resin

解吸是衡量聚酰胺樹脂分離天然產(chǎn)物的又一大重要參數(shù)。由圖4可看出，不同的乙醇濃度對樹脂的洗脫率隨著乙醇濃度上升而增強，雖然在95%的洗脫率最高，但考慮穩(wěn)定因素與經(jīng)濟原因，選定70%乙醇作為最佳洗脫濃度。

2.5.2 解析時間對樹脂解析率的影響

按照1.2.5.2方法，考察不同解析時間對樹脂解析率的影響，結果如圖5所示。

由圖5可知，解析率隨著震蕩時間的增長先有增加的趨勢，但超過4 h吸附率趨于平緩，相差不大。根據(jù)實際情況分析，選擇震蕩4 h作為最佳解析震蕩時間條件。

2.6 動態(tài)工藝的研究

2.6.1 徑高比對樹脂吸附量的影響

按照1.2.6.1方法，考察不同徑高比對樹脂吸附率的影響，結果如表1所示。

圖3 不同吸附時間對樹脂吸附率的影響Figure 3Effect of adsorption time on rate of resin adsorption

由表1可知，徑高比越大越有利于吸附，柱高為10.0 cm時，上樣時可觀察到吸附過程中的穩(wěn)定性好，馬鈴薯皮粗提物在聚酰胺樹脂上呈現(xiàn)明顯的梯度變化，同時吸附時間適宜；小于10.0 cm時，洗脫時間太短，分離效果較差；且2.0∶10.0接近于層析柱（2.0 cm×20 cm）高的2∕3，故選擇2.0∶10.0的徑高比條件，即使用20 g樹脂裝柱為最佳。

2.6.2 樣品上柱水洗體積對回收率的影響

按照1.2.6.2方法，考察不同上樣水洗體積對回收率的影響，結果如表2所示。

圖4 乙醇濃度對洗脫率的影響Figure 4Effect of ethanol concentration on elution rate

圖5 解析時間對解析率的影響Figure 5Effect of desorption time on desorption rate

表1 層析柱徑高比對樹脂吸附率的影響Table 1Effect of diameter/height ratio of column on adsorption rate

表2 上樣水洗體積對回收率的影響Table 2Effect of sample water volume on recovery rate

試驗結果表明，隨著上樣后水洗體積的增加，損失濃度有所上升（此未得到一樣體積），25 mL水洗雖然損失最小，但略為不夠充分，而50 mL水洗相對25 mL水洗更為充分，故選擇50 mL水洗作為最佳工藝條件。

2.6.3 洗脫曲線

通過1.2.6.3最佳條件下的洗脫曲線試驗，結果見圖6、圖7。

由兩組數(shù)據(jù)圖可看出，呈現(xiàn)聚酰胺層析柱分離純化馬鈴薯黃酮的洗脫曲線對稱性較好，峰面積較好，在pH為6時，洗脫用量在34 mL左右與pH為3時，洗脫用量55 mL左右，有一個微小的峰，可能是黃銅類化合物中不同組分的物質被分離了。綜上所述，選pH為6聚酰胺樹脂分離純化馬鈴薯皮黃酮具有較好的效果。

圖6 pH為6的洗脫曲線Figure 6Elution curve when pH value set at 6

圖7 pH為3的洗脫曲線Figure 7Elution curve when pH value set at 3

3 討論

本研究以馬鈴薯皮黃酮提取物為研究對象，通過聚酰胺樹脂對馬鈴薯皮提取物中黃酮類化合物的吸附及其解析性能試驗，用聚酰胺樹脂對馬鈴薯皮中提取的黃酮類化合物進行分離純化。聚酰胺樹脂對馬鈴薯皮提取物的分離純化效果好[11,12]，聚酰胺樹脂對于黃酮的吸附率和解析率達到95.31%和30.56%。通過靜態(tài)吸附和解析試驗可知，馬鈴薯皮黃酮提取物在30℃、pH為6條件下，經(jīng)過4 h吸附能達到好的吸附，以70%乙醇溶液在30℃條件下，振蕩4 h可得到較好的靜態(tài)洗脫效果；選用20 g聚酰胺樹脂裝入2.0 cm×20.0 cm規(guī)格的層析柱中，徑高比為2.0:10.0，得到較好的洗脫效果。通過柱層析試驗可知，聚酰胺樹脂分離純化馬鈴薯皮黃酮的較好條件是：馬鈴薯皮黃酮粗提液上樣濃度為0.184 mg∕mL、pH為6左右、上樣流速為2～3 mL∕min，以70%乙醇作為洗脫劑。使用內徑為2.0 cm、柱高10.0 cm的聚酰胺層析柱可達到較好的分離純化效果。

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Separation and Purification of Flavonoids from Potato
Peel with Polyamide Resin

ZHANG Wei1＊,LUO Yaqin2
(1.Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China;
2.Oriental Institute of Science and Technology,Changsha,Hunan 410128,China)

The effectiveness of separation and purification of total flavonoids from potato peel with polyamide resin was studied.Both static adsorption experiments and dynamic adsorption experiments were conducted to study the effects of various factors on the adsorption and desorption of flavonoids.The optimal desorption conditions for static adsorption were determined as being 70%ethanol as desorption solution,pH value at 6,temperature at 30℃,and oscillation for 4 hours following by store for 24 hours.For 20 g of polyamide resin,the optimal desorption conditions for dynamic adsorption were determined as being 70%ethanol as desorption solution,and 2.0/10.0(cm/cm)for diameter to height ratio of the chromatographiccolumn.

potato peel;flavonoid;polyamide resin;separation and purification

S532

B

1672－3635（2014）03-0138-06

2014-02-27

湖南省科學技術廳科技計劃項目（2012NK3083）；湖南省自然科學基金項目（11JJ3029）。

張薇（1962-），女，教授，主要從事應用化學研究。

張薇,E-mail:zhangwei6261@hotmail.com。