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    脊髓缺血再灌注損傷后 μ-Calpain mRNA 及蛋白的表達(dá)

    2014-02-14 02:59:24卜國云杜區(qū)成吳葉鄧樹才朱加亮商衛(wèi)林
    中國骨與關(guān)節(jié)雜志 2014年12期
    關(guān)鍵詞:造模蛋白酶脊髓

    卜國云 杜區(qū)成 吳葉 鄧樹才 朱加亮 商衛(wèi)林

    脊髓缺血再灌注損傷后 μ-Calpain mRNA 及蛋白的表達(dá)

    卜國云 杜區(qū)成 吳葉 鄧樹才 朱加亮 商衛(wèi)林

    目的探討鈣調(diào)蛋白 μ-Calpain 在脊髓缺血再灌注損傷中的表達(dá)及意義。方法建立成年SD 大鼠缺血再灌注損傷模型,利用實時熒光定量 PCR 技術(shù)及 Western-blot 技術(shù)檢測模型建立后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及 72 h μ-Calpain mRNA 及蛋白的表達(dá)情況。利用 Western-blot 技術(shù)檢測 μ-Calpain 特異性底物 α-II Spectrin 的降解,并與對照組進(jìn)行對比。結(jié)果與對照組相比,脊髓缺血再灌注損傷模型建立后 2 h,損傷段脊髓 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)開始增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,12 h 后明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05 ),48 h 達(dá)峰值 ( P<0.001 ),72 h 后仍有 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)且高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05 )。模型建立后 2 h 損傷段脊髓 μ-Calpain 蛋白增高,48 h 達(dá)峰值 ( P<0.001 ),72 h 后 μ-Calpain 蛋白仍高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P<0.05 )。α-II Spectrin 降解在模型建立后 2 h 即出現(xiàn),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P>0.05 ),72 h 后有少量 α-II Spectrin 殘留。結(jié)論脊髓缺血再灌注損傷模型建立后,μ-Calpain mRNA 及蛋白表達(dá)增加,對其特異性底物 α-II Specrin 進(jìn)行降解,參與了脊髓缺血再灌注損傷的病理過程。

    卡配因;縮蛋白;再灌注損傷;脊髓損傷

    在原發(fā)性脊髓損傷后,一系列繼發(fā)性病理改變 導(dǎo)致神經(jīng)功能的進(jìn)一步喪失[1]。繼發(fā)性損傷的機制包括脊髓缺血、細(xì)胞膜氧化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)外離子失衡、細(xì)胞內(nèi)蛋白酶系統(tǒng)的病理性激活、細(xì)胞骨架破壞等[2]。Calpain 蛋白是廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白酶,被 Ca2+激活后分解細(xì)胞骨架。本研究利用大鼠脊髓缺血性損傷模型,研究脊髓在缺血性損傷后 Calpain 蛋白不同時間段的表達(dá)情況。

    材料與方法

    一、實驗動物與分組

    成年雄性 SD 大鼠 70 只,體重 250~300 g,隨機分為對照組和脊髓缺血后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及 72 h 組,每組 10 只。實驗動物由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實驗動物科提供。

    二、主要試劑

    Trizol 試劑,美國 Invitrogen 公司;SuperScript First-Strand Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒,美國 Invitrogen公司;RealMasterMix SYBR Green 試劑盒,天根公司;兔抗鼠 μ-Calpain 抗體 ( Santa Cruz,美國 );兔抗鼠 α-II Spectrin 抗體 ( Santa Cruz,美國 )。羊抗兔 IgG ( 北京中杉金橋 );ECL 試劑盒 ( Amersham Pharmacia,美國 )。

    三、損傷模型制作及取材

    速眠新按 0.02 ml / 20 g 腹腔注射進(jìn)行麻醉,采用 Zivin 法制作動物模型。手術(shù)在無菌條件下操作。動物先俯臥固定于手術(shù)臺上,消毒后經(jīng)后正中入路切除 L2~4椎板,暴露 L3~4節(jié)段硬脊膜;關(guān)閉切口后,置動物于仰臥位,經(jīng)腹正中入路暴露腹主動脈,于左腎動脈起始部遠(yuǎn)端以動脈夾夾閉腹主動脈40 min。對照組僅暴露至左腎動脈起始部遠(yuǎn)端。實驗組按不同時間點處死動物,對照組在術(shù)后 2 h 處死。取出損傷段脊髓,0 ℃ 生理鹽水沖洗后液氮中保存。

    四、總 RNA 及總蛋白的提取

    采用 Trizol 法提取總 RNA 及總蛋白,操作步驟嚴(yán)格按 Trizol 說明書進(jìn)行。所得 RNA 經(jīng) 10 g / L 瓊脂糖凝膠電泳檢測可見 5 S、18 S 及 28 S 三條帶,未見RNA 降解帶及 DNA 污染帶。Trizol 提取 RNA 后,保留有機相,沉淀 DNA 后取上清液提取蛋白質(zhì),以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用 Bradford 法用紫外可見分光光度儀測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度至 10 μg / μl。

    五、cDNA 合成及實時熒光定量 PCR

    使用 SuperScript First-Strand Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒,具體步驟按試劑盒說明書操作。所得cDNA 在 -20 ℃ 條件下保存。以 β-actin 為內(nèi)參,進(jìn)行實時熒光定量 PCR。μ-Calpain 上游引物為 5’-CTG TCA AAC CCC C CAG TTC AT-3’,下游引物為5’-GCA GCC AAG AGC CAA CAG T-3’,產(chǎn)物片段 213 bp。β-actin 上游引物為 5’-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3’;下游引物為 5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’,產(chǎn)物片段 150 bp。按 RealMasterMix SYBR Green 試劑盒說明書進(jìn)行操作,反應(yīng)條件如下:94 ℃ 預(yù)變性 2 min;94 ℃ 變性20 s;56 ℃ 退火 30 s;60 ℃ 延伸 40 s,40 個循環(huán)。μ-Calpain 的表達(dá)值相對于 β-actin 表達(dá)水平計算 ( 相對定量法:Ratio=2-△△CT)。

    六、Western-blot 檢測 μ-Calpain 及其底物 α-II Spectrin

    取總蛋白樣本 5 μl,加入 2×SDS-PAGE 上樣緩沖液,加熱至 100 ℃ 使蛋白充分變性,進(jìn)行電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。取出 PVDF 膜后,洗去轉(zhuǎn)膜液,加入 Western 封閉液,在搖床上緩慢搖動,室溫封閉 2 h,加入 μ-Calpain 一抗 ( 1∶500 ),4 ℃緩慢搖動孵育過夜。加入 μ-Calpain 二抗 ( 1∶5000 )及 β-actin 抗體 ( 1∶10000 ),在 ECL kit 中顯色,膠片曝光、顯影。同法對 α-II Spectrin 進(jìn)行 Westernblot 分析。

    七、統(tǒng)計學(xué)分析

    采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,采用 t 檢驗進(jìn)行對照組與各時間點實驗組比較,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、脊髓缺血再灌注損傷后 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)

    實驗組術(shù)后 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)隨時間的推移而升高,2~6 h μ-Calpain mRNA 與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P>0.05 ),12 h 開始增高,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P<0.05 ),48 h 達(dá)峰值,48~72 h 下降,但仍高于對照組 ( 圖1,表1 )。

    圖1 對照組及實驗組 μ-Calpain mRNA 的相對表達(dá)Fig.1 The relative expressions of μ-Calpain mRNA in the control and experimental groups

    表1 對照組及實驗組 μ-Calpain mRNA 的相對表達(dá) (±s )Tab.1 The expressions of μ-Calpain mRNA in the control and experimental groups (±s )

    表1 對照組及實驗組 μ-Calpain mRNA 的相對表達(dá) (±s )Tab.1 The expressions of μ-Calpain mRNA in the control and experimental groups (±s )

    注:a與對照組相比,P < 0.05Notice:aMeant when compared with that of the control group, P<0.05

    分組 n μ-Calpain mRNA ( 對數(shù)值 )對照組 10 0.72±0.099 2 h 組 10 0.73±0.087 6 h 組 10 0.79±0.070 12 h 組 10 1.01±0.099a24 h 組 10 1.10±0.077a48 h 組 10 1.38±0.091a72 h 組 10 1.21±0.069a

    二、Western-blot 結(jié)果

    與對照組比較,實驗組 μ-Calpain 蛋白在術(shù)后6 h 開始增高,48 h 達(dá)峰值,72 h 下降,但仍高于對照組 ( P<0.05 ) ( 圖2,表2 );α-II Spectrin 在造模成功后 2 h 就開始降解,但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P>0.05 ),6~72 h α-II Spectrin 蛋白顯著降低 ( 圖3,表3 )。Western-blot 電泳結(jié)果 ( 圖4 )。

    圖2 對照組及實驗組 μ-Calpain 蛋白的相對表達(dá)Fig.2 The relative expressions of μ-Calpain protein in the control and experimental groups

    表2 對照組及實驗組 μ-Calpain 蛋白的相對表達(dá) (±s )Tab.2 The relative expressions of μ-Calpain protein in the control and experimental groups (±s )

    表2 對照組及實驗組 μ-Calpain 蛋白的相對表達(dá) (±s )Tab.2 The relative expressions of μ-Calpain protein in the control and experimental groups (±s )

    注:a與對照組相比,P < 0.05Notice:aMeant when compared with that of the control group, P<0.05

    分組 n μ-Calpain 蛋白 ( 相對值 )對照組 10 0.47±0.031 2 h 組 10 0.47±0.061 6 h 組 10 0.67±0.083a12 h 組 10 0.82±0.091a24 h 組 10 0.89±0.078a48 h 組 10 1.54±0.070a72 h 組 10 1.25±0.054a

    表3 對照組及實驗組 α-II Spectrin 的相對表達(dá) (±s )Tab.3 The relative expressions of α-II spectrin in the control and experimental groups (±s )

    表3 對照組及實驗組 α-II Spectrin 的相對表達(dá) (±s )Tab.3 The relative expressions of α-II spectrin in the control and experimental groups (±s )

    注:a與對照組相比,P < 0.05Notice:aMeant when compared with that of the control group, P<0.05

    分組 n α-II Spectrin ( 相對值 )對照組 10 15.24±0.788 2 h 組 10 14.59±1.054 6 h 組 10 12.55±0.707a12 h 組 10 10.44±0.691a24 h 組 10 9.10±1.033a48 h 組 10 6.06±0.403a72 h 組 10 5.08±1.100a

    圖4 對照組及造模后各時間點蛋白條帶Fig.4 The protein band at different time points after the model was established in the control group

    討 論

    脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,原發(fā)性損傷決定了脊髓損傷的程度,而繼發(fā)性損傷可以引起脊髓結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步破壞,限制了脊髓功能的恢復(fù),脊髓的出血和缺血再灌注損傷是繼發(fā)性損傷中的重要機制[3]。本研究中,筆者利用脊髓的缺血再灌注損傷模型對脊髓損傷后 μ-Calpain mRNA、蛋白及其底物 α-II Spectrin 進(jìn)行研究。

    脊髓損傷后導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的感覺和運動缺失。脊髓損傷后的病理變化復(fù)雜,有多種生物化學(xué)機制參與了細(xì)胞和軸突的破壞。細(xì)胞內(nèi) Ca2+超負(fù)荷被認(rèn)為是缺血再灌注損傷的重要機制之一。Ca2+超負(fù)荷可導(dǎo)致線粒體功能破壞、各種鈣依賴蛋白酶和脂肪酶的激活。Calpain 蛋白是一種 Ca2+依賴性蛋白酶,屬于半胱氨酸蛋白酶家族,廣泛地存在于哺乳動物的多種組織中,參與多種病理生理過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,Calpain 以前蛋白酶的形式存在于靜止細(xì)胞中,對正常細(xì)胞的細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝有調(diào)節(jié)作用[4]。Calpain 主要分為兩個亞型,即μ-Calpain 和 m-Calpain,受不同濃度的 Ca2+激活。Calpain 蛋白受 Ca2+激活后,可以降解細(xì)胞骨架蛋白、膜蛋白,并與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

    在脊髓重物撞擊損傷模型中,Ray 等[5]發(fā)現(xiàn)損傷段脊髓內(nèi) μ-Calpain mRNA 在傷后的 72 h 內(nèi)都沒有明顯增高,而 μ-Calpain 蛋白的活性在傷后的 4 h開始增強,在 48 h 達(dá)到峰值,但是該作者在另一項實驗中發(fā)現(xiàn),μ-Calpain mRNA 和蛋白在造模后的24 h 同時達(dá)到最大值[6]。而張子峰等[7]利用免疫組化技術(shù)對大鼠的脊髓缺血再灌注損傷模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),μ-Calpain 蛋白在造模后的 72 h 表達(dá)最多,在7 天后仍有表達(dá)。本實驗結(jié)果顯示,在造模后的最初 6 h 內(nèi),μ-Calpain mRNA 并沒有顯著增加,而造模后的 72 h 內(nèi)都保持了非常高的水平;μ-Calpain 蛋白的表達(dá)在傷后早期就有了明顯的增高。造成本實驗與其它實驗結(jié)果的差異可能有以下兩項原因:( 1 )年齡是影響脊髓損傷后 Calpain 蛋白表達(dá)的重要因素之一,Wingrave 等[8]通過實驗發(fā)現(xiàn)青年鼠比成年鼠在脊髓損傷后 Calpain 蛋白的表達(dá)要低,本實驗的動物體重偏大,在 250~300 g,而其它幾項實驗所采用的實驗動物體重在 200 g 左右,這一點可能會造成實驗結(jié)果的差異;( 2 ) 脊髓損傷的撞擊模型除了能導(dǎo)致脊髓的短暫缺血外,能造成更廣泛的組織破壞,使 Ca2+大量快速內(nèi)流,使 Calpain 快速轉(zhuǎn)錄及翻譯,本實驗所采取的模型為缺血再灌注模型,損傷程度輕于撞擊模型。Lee 等[9]發(fā)現(xiàn),在兔的脊髓缺血再灌注損傷模型中,μ-Calpain 蛋白在造模后30 min 即有明顯的增加,并隨著時間的推移而下降。通過上述實驗結(jié)果分析,μ-Calpain 蛋白的表達(dá)在不同的脊髓損傷模型和不同種屬之間的表達(dá)有可能是不相同的,這一點值得深入地研究。

    α-II Spectrin 蛋白是細(xì)胞骨架蛋白之一,分子量為 230KD,在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)于神經(jīng)元的胞體、樹突及軸突,是 μ-Calpain 的特異性底物之一,可在 Calpain 蛋白的催化下降解為分子量為 150KD的 Cleaved α-II Spectrin。實驗結(jié)果表明,脊髓缺血再灌注損傷后,μ-Calpain 蛋白的特異性底物α-II Spectrin 即出現(xiàn)降解,但在造模后的 6 h 才出現(xiàn)明顯降解,這與 μ-Calpain 蛋白在造模后升高的趨勢相同。α-II Spectrin 的降解說明細(xì)胞骨架蛋白逐漸被破壞,神經(jīng)組織發(fā)生潰變。μ-Calpain 在降解α-II Spectrin 的同時,還降解 NF200、68KD NFP等,使細(xì)胞骨架蛋白遭受進(jìn)一步破壞,提示可以將μ-Calpain 作為保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)的治療靶點,保持神經(jīng)結(jié)構(gòu)的完整性。

    本實驗中,μ-Calpain 蛋白的升高和 α-II Spectrin的降解要早于 α-Calpain mRNA 的升高,這可能是在脊髓損傷發(fā)生后 Ca2+內(nèi)流首先激活了 μ-Calpain進(jìn)行細(xì)胞骨架的降解,同時通過其它機制先促使μ-Calpain 的翻譯增強,然后促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的增強。

    脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷導(dǎo)致了脊髓結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步破壞,μ-Calpain 作為 Ca2+的激活蛋白酶,參與了神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維骨架蛋白的分解。本研究結(jié)果提示,如果能夠及時阻止 μ-Calpain 蛋白的轉(zhuǎn)錄及激活,有可能阻止細(xì)胞骨架蛋白的降解,保留神經(jīng)結(jié)構(gòu),進(jìn)而為神經(jīng)功能恢復(fù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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    ( 本文編輯:馬超 王萌 )

    Expressions of μ-Calpain mRNA and protein after spinal cord ischemia-reperfusion injury


    BU Guo-yun, DU Qu-cheng, WU Ye, DENG Shu-cai, ZHU Jia-liang, SHANG Wei-lin. Department of Spine Surgery, Tianjin Hospital, Tianjin, 300211, PRC

    ObjectiveTo explore the expressions and signifcance of μ-Calpain after spinal cord ischemiareperfusion injury.MethodsAn adult Sprague-Dawley ( SD ) rat model of spinal cord ischemia-reperfusion injury was established. Quantitative real-time furoscent polymerase chin reaction ( PCR ) and Western-blot technique were used to detect the expressions of mRNA and protein of μ-Calpain at 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after the model was established. The degradation of α-II specrin of the specifc substrate of of μ-Calpain was detected by Westernblot technique, and the results were compared with that of the control group.ResultsThe expressions of μ-Calpain mRNA of the injured spinal cord began to increase at 2 h after the model was established, but there were no statistically significant differences. The expressions were obviously increased at 12 h, and there were statistically significant differences ( P<0.05 ). The peak was reached at 48 h after the model was established ( P<0.001 ). The expressions of μ-Calpain mRNA remained at a higher level at 72 h when compared with that of the control group, and there were statistically signifcant differences ( P<0.05 ). The expressions of μ-Calpain protein of the injured spinal cord began to increase at 2 h after the model was established, and the peak was reached at 48 h ( P<0.001 ). The expressions of μ-Calpain protein remained at a higher level at 72 h after the model was established when compared with that of the control group, and there were statistically signifcant differences ( P<0.05 ). The α-II spectrin began to degenerate at 2 h after the model was established, but there were no statistically signifcant differences. There were still some α-II spectrin remains at 72 h.ConclusionsThe expressions of μ-Calpain mRNA and protein are increased after the spinal cord ischemia-reperfusion injury model is established, and meanwhile the α-II specrin of its specifc substrate begins to degenerate. The μ-Calpain is involved in the pathological course of spinal cord ischemia-reperfusion injury.

    Calpain; Spectrin; Reperfusion Injury; Spinal Cord Injuries

    10.3969/j.issn.2095-252X.2014.12.014

    :R683.2

    全軍十二五面上項目 ( CWS11J100 )

    300211 天津市天津醫(yī)院脊柱一科 ( 卜國云、鄧樹才 );100048 北京,解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨二科( 杜區(qū)成、吳葉、朱加亮、商衛(wèi)林 )

    吳葉,Email: wuyespine@126.com

    2013-12-22 )

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