童春堂，車曉宇，李雪輝，尤蘭華，郭沛艷，陳杭薇

目前非典型病原體(主要指肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌)及病毒在呼吸道感染患者中的檢出率日漸升高，隨著檢測(cè)方法的改進(jìn)及研究的深入，該病原體及病毒檢測(cè)在呼吸道感染診治中的地位越來(lái)越受到臨床醫(yī)師的重視。本研究采用間接免疫熒光法(indirect immuno fluorescence，IIF)快速定性檢測(cè)住院呼吸道感染患者血清9種常見呼吸道病原體及病毒急性期IgM抗體，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象 北京軍區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科2012年2月1日—2013年5月31日收治呼吸道感染488例，男300例，女188例;年齡17～99(62.3±21.4)歲。病種:急性支氣管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)、支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘急性發(fā)作、間質(zhì)性肺病、肺癌、發(fā)熱待查等。

1.2 檢測(cè)試劑 9種呼吸道感染病原體及病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒為西班牙VIRCELL公司原裝進(jìn)口產(chǎn)品，購(gòu)自鄭州安圖科技發(fā)展有限公司。采用IIF技術(shù)可檢測(cè)9種IgM抗體:嗜肺軍團(tuán)菌(legionella pneumophila，LP)血清1型(孔1)，肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP，孔2)，貝氏柯克斯體(coxiella burnetii，Cb，孔 3)，肺炎衣原體(chlamydia pneumonia，CP，孔 4)，腺病毒(adenovirus，ADV，孔5)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV，孔6)，流感病毒 A(influenza virus A，F(xiàn)luA，孔7)，流感病毒 B(influenza virus B，F(xiàn)luB，孔8)，副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)1、2、3 型(孔 9)，孔10為質(zhì)控孔，有效期內(nèi)按照試劑盒使用說(shuō)明書操作。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本收集與處理:①患者入院24 h內(nèi)，靜脈穿刺采集血液2～3 ml，2000 r/min離心5 min后取血清待測(cè)，按1∶1比例稀釋血清樣本;②向稀釋后的血清加入吸附劑，以3000 r/min離心10～15 min，于試劑盒內(nèi)自帶“載玻片”的每孔(9個(gè)檢測(cè)孔和1個(gè)質(zhì)控孔)中加入15μl處理后血清，于37℃下溫育90 min;③用磷酸鹽緩沖液緩慢沖洗載玻片后放置水平搖床搖動(dòng)10 min，再用蒸餾水緩慢沖洗;④將載玻片自然晾干，每孔加入15μl熒光素標(biāo)記的抗人IgM磷酸緩沖液后放入試劑盒37℃溫育30 min，晾干后加封閉介質(zhì)，加蓋玻片，即刻在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，如不能立即觀察，可2～8℃避光放置，但不能超過(guò)24 h。

1.3.2 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性:FluA、FluB、ADV、PIV、RSV抗原與血清IgM抗體結(jié)合后細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或細(xì)胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光(在PIV、RSV與IgM抗體結(jié)合后的細(xì)胞中可能同時(shí)觀察到著色的合胞);CP、LP、Cb與IgM抗體結(jié)合后的整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)蘋果綠色熒光;MP與陽(yáng)性血清結(jié)合后在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光。陰性:CP、LP和Cb與IgM抗體結(jié)合后整個(gè)細(xì)胞無(wú)熒光，MP、FluA、FluB、ADV、PIV 和 RSV與IgM抗體結(jié)合后的細(xì)胞呈紅色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道病原體及病毒IgM抗體檢測(cè)結(jié)果 488例9種呼吸道病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性總檢出率為57.0%(278/488，設(shè)定1種病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性即算作1例)，Cb未檢出，見表1。

表1 住院呼吸道感染患者呼吸道病原體及病毒IgM抗體檢測(cè)結(jié)果(n=488)

2.2 呼吸道病原體及病毒IgM抗體混合感染檢出情況 488例中FluA+FluB陽(yáng)性9例，F(xiàn)luA+LP陽(yáng)性11例，F(xiàn)luA+MP陽(yáng)性7例，F(xiàn)luA+PIV陽(yáng)性3例，F(xiàn)luB+MP陽(yáng)性 3例，F(xiàn)luB+LP陽(yáng)性 2例，F(xiàn)luB+PIV陽(yáng)性2例，LP+ADV陽(yáng)性3例，LP+MP陽(yáng)性4例，LP+PIV陽(yáng)性1例。兩種及以上混合感染陽(yáng)性檢出率為13.9%(68/488)，其中 FluA、LP、FluB、MP合并其他病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性分別為 36、25、20、18 例。

2.3 不同季節(jié)、病種、年齡段呼吸道病原體及病毒IgM抗體檢出情況 春季和冬季FluA IgM抗體陽(yáng)性檢出率分別為 20.0%(40/200)、27.8%(35/126)，顯著高于夏秋季，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);春季LP IgM抗體陽(yáng)性檢出率為22.0%(44/200)高于秋季的6.0%(5/84)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其他病原體及病毒不同季節(jié)間IgM抗體陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。不同病種間呼吸道病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。15～65歲年齡段LP及MP IgM抗體陽(yáng)性檢出率分別為 19.0%(43/226)、11.9%(27/226)，高于 65～99歲年齡段的 10.7%(28/262)、6.1%(16/262)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩年齡段其余病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表2 住院呼吸道感染患者不同季節(jié)呼吸道病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性檢出結(jié)果

表3 不同病種住院呼吸道感染患者呼吸道病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性檢出結(jié)果

表4 不同年齡住院呼吸道感染患者呼吸道病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性檢出結(jié)果

注:FluA:流感病毒A，LP:嗜肺軍團(tuán)菌，MP:肺炎支原體，F(xiàn)luB:流感病毒B，PIV:副流感病毒，ADV:腺病毒，RSV:呼吸道合胞病毒，CP為肺炎衣原體;aP＜0.05

3 討論

研究表明，近年來(lái)肺炎鏈球菌的感染率有所下降，而呼吸道非典型病原體及病毒的感染率不斷上升［1-2］。呼吸道非典型病原體及病毒致病性強(qiáng)、傳播快、起病急，人群不易形成持久免疫力，臨床特征缺乏特異性，容易造成抗生素的濫用，給疾病的診治及防控造成了一定的困難［3］。因而，快速高效地檢出呼吸道非典型病原體及病毒對(duì)疾病的及時(shí)診治及疫情報(bào)告有重要意義。

呼吸道非典型病原體及病毒的檢測(cè)方法包括病原體的分離和培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等方法，但上述方法由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)而導(dǎo)致病原診斷延遲。本研究采用IIF檢測(cè)9種呼吸道病原體及病毒IgM抗體，該法可對(duì)血清中反映新近發(fā)生感染的急性期IgM抗體進(jìn)行定性檢測(cè)［4］，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)范圍廣、利于早期發(fā)現(xiàn)且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)［5］。本研究結(jié)果顯示，488例9種呼吸道病原體及病毒IgM抗體陽(yáng)性總檢出率高達(dá)57.0%，以FluA IgM抗體陽(yáng)性檢出率最高，其次為L(zhǎng)P、MP、FluB，高于劉又寧等［6］2004年進(jìn)行的一項(xiàng)呼吸道病原學(xué)調(diào)查結(jié)果?？紤]此次檢測(cè)對(duì)象并不能排除有IgM抗體長(zhǎng)期攜帶者，因有相關(guān)研究報(bào)道部分呼吸道感染患者產(chǎn)生的IgM抗體可持續(xù)存在1年或更長(zhǎng)時(shí)間［7］。本研究488例中存在一定比例的混合感染，以FluA、LP、FluB、MP合并其他病原體及病毒最為多見，再度證明了FluA、LP和MP是呼吸道感染的主要病原［8-9］，混合感染是其特點(diǎn)［10-12］，提示臨床醫(yī)師應(yīng)當(dāng)重視非典型病原體及病毒在成人呼吸道感染中的危害。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)luA IgM抗體在春季和冬季的陽(yáng)性檢出率均顯著高于夏秋季節(jié);而春季LP IgM抗體陽(yáng)性檢出率高于秋季，與文獻(xiàn)［13］報(bào)道不太相符。本研究結(jié)果還顯示，呼吸道非典型病原體及病毒在15～65歲年齡段患者中LP及MP IgM抗體陽(yáng)性檢出率較高，與智霞萍等［14］調(diào)查結(jié)果一致。提示呼吸道非典型病原體及病毒的分布與患者檢測(cè)季節(jié)、年齡密切相關(guān)，與近年流感流行的季節(jié)相符。上述結(jié)果對(duì)呼吸道感染患者的臨床經(jīng)驗(yàn)性治療有著重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，呼吸道非典型病原體及病毒為呼吸道感染的重要病原，其混合感染不容忽視，此外還應(yīng)重視季節(jié)、年齡、環(huán)境等因素對(duì)呼吸道非典型病原體及病毒分布的影響。

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