李政龍，申 奧，欒維江

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

同源異型盒（homeobox，HB）是同源異型基因中都具有的保守基序，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中.該序列出現(xiàn)在真核生物進(jìn)化的早期，在生物發(fā)育中具有重要功能[1].由同源異型盒編碼的蛋白序列稱(chēng)為同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）.植物HB轉(zhuǎn)錄因子家族可分為6類(lèi)：HD-Zip（homeodomain-leucinezipper）、KNOX （knotted-like homeobox）、PHD-Finger（plant homeodomain-finger）、BELL（bell homeodomain）、WOX（Wuschel-related homeobox）和 ZF-HD（zinc fingerhomeodomain）[2].其中，HD-Zip由DNA同源異型結(jié)構(gòu)域和附加的leucine-zipper（亮氨酸拉鏈）元件組成[3]，主要參與調(diào)控植物正常生長(zhǎng)以及環(huán)境脅迫后植物的生長(zhǎng)發(fā)育[4].根據(jù)結(jié)構(gòu)域的保守性、序列結(jié)構(gòu)以及生理學(xué)功能，HD-Zip家族又可以分為HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ等4個(gè)亞家族[4].HD-ZipⅢ基因是近年來(lái)研究較多的一類(lèi)，在植物胚胎及胚后形態(tài)發(fā)生（頂端分生組織及側(cè)生分生組織的形成）、側(cè)生器官的極性建立和維管組織細(xì)胞分化為葉片的功能等方面具有重要作用[5-6].如擬南芥中HD-ZipⅢ基因家族包括 AtHB8、AVB1（REV）/IFL1//REVOL UTA、AtHB15/CORONA（CAN）、AtHB9（PHV）/PHAVO-LUTA和AtHB14（PHB）等5個(gè)成員，它們?cè)谡{(diào)控頂端分生組織的分化、側(cè)部器官的極性和次生維管的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2].水稻中HD-ZipⅢ也有5個(gè)成員，HDZ1和HDZ2是其中的2個(gè)基因.

植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是系統(tǒng)理解植物形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育和逆境耐性等必不可少的環(huán)節(jié)，也是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容[7].綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛使用的一種報(bào)告因子，該因子能在藍(lán)光或紫光的激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光[8]，具有檢測(cè)方便、高效、無(wú)需輔助因子和底物、對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)傷害等優(yōu)點(diǎn)[9]，常用于活細(xì)胞中蛋白的鑒定、跟蹤和分析.1994年Chalfie等[10]首次用GFP作為報(bào)告蛋白，之后，GFP作為報(bào)告蛋白在多種植物、動(dòng)物和微生物中均能夠成功表達(dá)，并逐漸發(fā)展為一項(xiàng)成熟的技術(shù)[11].

本課題組構(gòu)建了HDZ1和HDZ2轉(zhuǎn)錄因子的GFP融合表達(dá)載體，并分析其亞細(xì)胞定位，初步研究這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在水稻中的功能和作用.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水稻品種花11及煙草種植于天津師范大學(xué)人工氣候箱.農(nóng)桿菌菌株EHA105、pCAMBIA35S-GFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

從生長(zhǎng)約15d的水稻幼苗中提取RNA.利用RTPCR擴(kuò)增HDZ1和HDZ2基因編碼區(qū)（去除終止密碼子序列）. 所用 HDZ1的引物為 F：5′-TCAgagctc-ATTTGGCTTTGGCGAGGTAG-3′；R：5′-TACgtcgac-CACAAAGGACCAGTTGACGA-3′.HDZ2的引物為 F：5′-ATAgagctcGAGAAGAAGGAGAAGGGTCG-3′；R ：5′-CTGtctagaGACGAATGACCAGTTGACGA-3′.反應(yīng)條件為：95℃，3 min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，2.5min，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)；72℃，5min.回收目的片段.用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（HDZ1為samI和sacI，HDZ2為sacI和salI）與空載體pCAMBIA35S-GFP連接獲得融合表達(dá)載體.

1.3 電激轉(zhuǎn)化

將感受態(tài)細(xì)胞取出解凍，向感受態(tài)細(xì)胞中加入1～3 μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，加入電擊杯中，冰上冷卻2～3 min.將電擊杯置于電擊儀中1800V電擊后，取出電擊杯中的混合液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至1個(gè)月，28℃搖床（220r/min）活化 3 min.取200μL涂布LB平板（含50mg/L的卡那霉素或50mg/L的利福平），28℃培養(yǎng)2～3 d.

1.4 GFP融合載體的瞬時(shí)表達(dá)

挑取含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，單克隆于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d.待菌液濃度達(dá)到OD值為0.5時(shí)，取2mL菌液加入離心管中，12000r/min離心1min，去上清液，重復(fù)加入2mL菌液，12000r/min離心1min，去上清液.加入2mL注射液（1mol/L的MgCl2、1mol/L的MES和0.2mol/L的AS），充分振蕩混勻.將混合液在室溫下靜置4h，之后進(jìn)行煙草葉片轉(zhuǎn)化，3～4d后取煙草葉片表皮觀察GFP瞬時(shí)表達(dá).

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的同源比較

HDZ1和HDZ2是水稻HD-ZipⅢ家族成員，分別編碼1個(gè)由839和862個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì).HDZipⅢ蛋白含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次是同源異型結(jié)構(gòu)域（HD）、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（ZIP）、START結(jié)構(gòu)域（START）和MEKHLA結(jié)構(gòu)域，如圖1（a）所示.其中，HD和ZIP結(jié)構(gòu)域在植物中有較高保守性.通過(guò)對(duì)HDZ1和HDZ2蛋白的HD和ZIP序列比較，發(fā)現(xiàn)二者在HD結(jié)構(gòu)的約60個(gè)保守氨基酸序列中，只有 7處不同，分別為第 18、19、24、26、32、39、57號(hào)殘基，如圖 1（b）所示.

圖1 HDZ1和HDZ2蛋白的結(jié)構(gòu)域及同源性比較Fig.1 Homeodomain and comparison of HDZ1and HDZ2

2.2 GFP融合載體的構(gòu)建及其酶切檢測(cè)

按照水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)帶有與載體中酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因的ORF（去除終止密碼子序列）.由于該轉(zhuǎn)錄因子家族在植物頂端分生組織中有較高的表達(dá)[22]，因此收集發(fā)芽后15d的水稻幼苗，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng).HDZ1和HDZ2的ORF長(zhǎng)度分別為2520bp和2589bp.為了驗(yàn)證獲得的目的基因在PCR過(guò)程中是否有堿基突變，對(duì)獲得的條帶進(jìn)行回收純化，電泳結(jié)果如圖2a所示，再進(jìn)行下一步的酶切和連接.

圖2 目的基因和重組質(zhì)粒的電泳圖Fig.2 Electropherogram of target genes and recombinant plasmids

連接轉(zhuǎn)化后挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定，重組質(zhì)粒都切出了預(yù)期的約2.5kb的片段，如圖2b所示，進(jìn)行測(cè)序.與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列（HDZ1的基因號(hào)為L(zhǎng)OC_Os03g01890，HDZ2為 LOC_Os03g43930）進(jìn)行比對(duì)和確認(rèn)，表明目的基因成功連接到載體中，可以進(jìn)行下一步的亞細(xì)胞定位.

2.3 HDZ1和HDZ2亞細(xì)胞定位

重組質(zhì)粒（pCAMBIA35S-HDZ1-GFP、pCAMBIA35SHDZ2-GFP）和空載體質(zhì)粒（pCAMBIA35S）轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，注射煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用熒光顯微鏡（Leica DM5000B）觀察，確定HDZ1和HDZ2在細(xì)胞中的作用部位.結(jié)果表明：在空載體對(duì)照中，GFP熒光信號(hào)在整個(gè)細(xì)胞中都有表達(dá)，無(wú)表達(dá)特異性，如圖3（a）和圖3（e）所示；在pCAMBIA35S-HDZ1-GFP融合瞬時(shí)表達(dá)中，GFP熒光信號(hào)與明場(chǎng)中的氣孔完全重合，如圖3b～3d所示，這說(shuō)明HDZ1定位在氣孔細(xì)胞中，可能在植物的氣孔中發(fā)揮著重要作用；pCAMBIA35S-HDZ2-GFP融合瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞中，GFP熒光信號(hào)主要定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，如圖 3（f）～圖 3（h）所示.

圖3 目的基因在煙草葉片下表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.3 Transient expression of target genes in epidermal cells of leaf of tobacco

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）也稱(chēng)反式作用因子（trans-acting factor），是一類(lèi)能夠與DNA或RNA中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過(guò)它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[12].從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，典型的植物轉(zhuǎn)錄因子由核定位信號(hào)區(qū)（nuclear localization signal，NLS）、DNA 結(jié)合區(qū)（DNA binding domain，BD）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（transcription regulation domain）和寡聚化位點(diǎn)區(qū)（oligomerization site）等4個(gè)功能區(qū)域組成[13].核定位信號(hào)區(qū)將轉(zhuǎn)錄因子定位到細(xì)胞核[14]，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中，如擬南芥中的Roc5[15]、大豆中的GmERF5[16]、小麥中的W17[17]等.但也有例外，如擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA6a在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)[18].目前，關(guān)于擬南芥HDZipⅢ轉(zhuǎn)錄因子家族亞細(xì)胞定位方面的研究很少，僅Zhong等[19]發(fā)現(xiàn)IFL基因定位在細(xì)胞核.在擬南芥的維管組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，ATHB8具有促進(jìn)維管組織分化的作用，過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素積累過(guò)多[13].REV、CAN、PHB和PHV可以調(diào)控頂端分生組織的分化和側(cè)部器官的極性，但REV與CAN、PHB、PHV在調(diào)控維管發(fā)育過(guò)程中作用相反[20].在葉片極性建立方面，REV和PHB的顯性突變體都出現(xiàn)了不同程度的近軸面化，產(chǎn)生了喇叭狀葉、棒狀葉和針狀葉[21].水稻HD-ZipⅢ家族基因與擬南芥HD-ZipⅢ家族基因具有同源性，在功能上可能也是調(diào)控頂端分生組織的分化和側(cè)部器官的極性.本課題組研究發(fā)現(xiàn)，水稻HDZ1轉(zhuǎn)錄因子定位在氣孔細(xì)胞中，猜測(cè)該基因可能在水稻葉片的生長(zhǎng)發(fā)育中起到一定作用；HDZ2定位在細(xì)胞膜上，其功能尚不清楚.雖然HDZ1和HDZ2具有較高的同源性，但在水稻的生長(zhǎng)發(fā)育中所起作用是否相同有待于進(jìn)一步研究.

[1] 劉國(guó)振，朱立煌.植物同源盒基因的克隆與功能研究[J].遺傳，1998，20（3）：42-47.

[2] 秦永芳，李登弟，李學(xué)寶.植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2009，31（4）：514-520.

[3]NAKASHIMA K，ITO Y，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K.Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses[J].Plant Physiol，2009，149（1）：88-95.

[4] HARRIS J C，HRMOVA M，LOPATO S，et al.Modulation of plant growth by HD-Zip classⅠandⅡtranscription factors in response to en-vironmental stimuli[J].New Phytol，2011，190（4）：823-837.

[5]朱瑩瑩，于亮亮，汪杏芬，等.HD-ZipⅢ轉(zhuǎn)錄因子家族與植物細(xì)胞分化[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48（2）：199-209.

[6]LUAN W J，SHEN A，JIN Z P，et al.Knockdown of OsHox33，a member of the classⅢ homeodomain-leucine zipper gene family，accelerates leaf senescence in rice[J].Science China：Life Sciences，2013，56（12）：1113-1123.

[7] 邢浩然，劉麗娟，劉國(guó)振.植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究進(jìn)展[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（增刊）：1-6.

[8]YANG F，MOSS L G，PHILLIPS G N J R.The molecular structure of green fluorescent protein[J].Nature Biotech，1996，14（10）：1246-1251.

[9] HEIM R，CUBITT A B，TSIEN R Y.Improved green fluorescence[J].Nature，1995，373（6516）：663-664.

[10]CHALFIE M，TU Y，EUSKIRCHEN G，et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science，1994，263（5148）：802-805.

[11]張俊蓮，王蒂，張金文，等.用綠色熒光蛋白和洋蔥表皮細(xì)胞檢測(cè)擬南芥rd29A基因啟動(dòng)子活性的方法[J].植物生理學(xué)通訊，2005，41（6）：815-819.

[12]BASTOLA D R，PETHE V V，WINICOV I.Alfin1，a novel zinc-finger protein in alfalfa roots that binds to promoter elements in the saltinducible MsPRP2gene[J].Plant Molecular Biology，1998，38（6）：1123-1135.

[13]OHASHI-ITO K，KUBO M，DEMURA T，et al.ClassⅢhomeodomain leucine-zipper proteins regulate xylem cell differentiation[J].Plant and Cell Physiology，2005，46（10）：1646-1656.

[14]羅紅麗，宋鳳鳴，鄭重.水稻homeodomain型轉(zhuǎn)錄因子基因OsBIHD1在抗病和抗逆反應(yīng)中起不同作用[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006：304.

[15]ZOU L，SUN X，ZHANG Z，et al.Leaf rolling controlled by the homeodomain leucine zipper class IV gene Roc5in rice[J].Plant Physiology，2011，156（3）：1589-1602.

[16]翟瑩，楊曉杰，孫天國(guó)，等.大豆轉(zhuǎn)錄因子GmERF5的克隆、表達(dá)及功能分析[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48（5）：498-506.

[17]趙云祥，徐兆師，陳明，等.小麥ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子W17的結(jié)合特異性及亞細(xì)胞定位分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（6）：1575-1582.

[18]鞏振輝，逯明輝，馬超，等.擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA 6a的克隆[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，36（4）：94-98.

[19]ZHONG R，YE Z H.IFL1，a gene regulating interfascicular fiber differentiation in Arabidopsis，encodes a homeodomain-leucine zipper protein[J].The Plant Cell Online，1999，11（11）：2139-2152.

[20]PRIGGE M J，OTSUGA D，ALONSO J M，et al.ClassⅢhomeodomain leucine-zipper gene family members have overlapping，antagonistic，and distinct roles in Arabidopsis development[J].Plant Cell，2005，17（1）：61-76.

[21]EMERYJF，F(xiàn)LOYDSK，ALVAREZJ，etal.Radialpatterningof Arabidopsis shoots by ClassⅢHD-ZIP and KANADI genes[J].Current Biology，2003，13（20）：1768-1774.