田靜，張學(xué)洪，陳俊，劉杰

多金屬富集植物李氏禾根系對(duì)銅吸收機(jī)理的研究

田靜，張學(xué)洪*，陳俊，劉杰

桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004

李氏禾（Leersia hexandra Swartz）是一種多金屬富集植物，通過研究其根系吸收銅的途徑和方式，有助于解釋李氏禾對(duì)銅的富集現(xiàn)象，為開發(fā)李氏禾修復(fù)銅污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。本文在溫室水培條件下，利用鈣離子通道抑制劑（LaCl3）和鉀離子通道抑制劑（TEA），研究了李氏禾根系銅吸收與鈣、鉀離子通道的關(guān)系；同時(shí)，在研究ATP酶抑制劑、解偶聯(lián)劑和低溫作用對(duì)銅吸收影響的基礎(chǔ)上，探討了李氏禾根系銅吸收與能量代謝的關(guān)系。結(jié)果表明，在1 mmol·L-1鈣離子通道抑制劑的作用下，李氏禾根對(duì)銅的吸收明顯被抑制了(p＜0.05)。處理48 h后，李氏禾根中銅的濃度較對(duì)照下降了39.2%。這說明李氏禾根吸收銅與鈣離子通道密切相關(guān)。在5 mmol·L-1鉀離子通道抑制劑的作用下，李氏禾根對(duì)銅的吸收與對(duì)照沒用顯著差異。這表明，李氏禾根系對(duì)銅的吸收可能不是通過鉀離子通道進(jìn)行的。ATP酶抑制劑釩酸鈉(Na3VO4)顯著地抑制李氏禾根對(duì)銅的吸收(p＜0.05)。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4處理48 h后，李氏禾根中銅的濃度較對(duì)照分別下降了26.2%和31.0%。由此，推測(cè)李氏禾根系對(duì)銅的吸收是一個(gè)消耗能量的過程。該結(jié)果與解偶聯(lián)劑抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。在25 μmol·L-1和50 μmol·L-1解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚(DNP)作用下，李氏禾根系中的銅濃度較對(duì)照分別下降了25.8%和42.7%。低溫處理對(duì)李氏禾根吸收銅的抑制作用較解偶聯(lián)劑和ATP酶抑制劑更為明顯。2 ℃下暴露48 h，李氏禾根中銅的濃度較對(duì)照(25 ℃)下降了60.1%。這進(jìn)一步證明了，李氏禾根系對(duì)銅的吸收存在消耗能量的主動(dòng)過程。

李氏禾；銅；吸收；抑制劑；主動(dòng)運(yùn)輸

銅是生物必須的營(yíng)養(yǎng)元素（BURKHEAD等，2009），適量的銅對(duì)人和動(dòng)植物是有益的，但過量的銅則會(huì)對(duì)人和動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害（倪才英等，2003）。在對(duì)環(huán)境污染較嚴(yán)重的Pb、Hg、Cd、Cu、As、Ni等重金屬中，Cu的排放量較大，每年約為939000 t（SINGH等，2003）。因此，銅污染是亟待解決的環(huán)境問題。

植物修復(fù)技術(shù)(phytoremediation)被認(rèn)為是修復(fù)銅等重金屬污染土壤和水體最經(jīng)濟(jì)有效的方法，以廉價(jià)、高效、具有審美價(jià)值和長(zhǎng)期應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛的推崇（KUMER等，1995；ZHAO和MCGRATH，2009）。該技術(shù)的理論核心是通過超富集植物或富集植物對(duì)重金屬的吸收和積累，從而去除土壤或水體中的重金屬。因此，超富集/富集植物作為植物修復(fù)的基礎(chǔ)和核心載體成為研究的熱點(diǎn)。

李氏禾(Leersia hexandra Swartz)是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的鉻超富集植物（張學(xué)洪等，2006）。已有研究表明，李氏禾對(duì)銅也表現(xiàn)出較強(qiáng)的富集能力（張學(xué)洪等，2008）。目前，人們對(duì)富集植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的機(jī)理認(rèn)識(shí)比較有限，主要的研究成果都來源于Cd、As、Zn等幾種重金屬（WEBER等，2004；VERBRUGGEN等，2009；ZHAO等，2009），關(guān)于富集植物吸收銅的機(jī)理研究相對(duì)較少。因此，李氏禾根對(duì)Cu的吸收途徑和方式會(huì)成為值得研究的科學(xué)問題，有助于解釋李氏禾對(duì)銅的富集現(xiàn)象，同時(shí)也為開發(fā)李氏禾修復(fù)鉻、銅復(fù)合污染環(huán)境的植物修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

本文通過水培實(shí)驗(yàn)研究了離子通道抑制劑、ATP酶抑制劑、解偶聯(lián)劑和低溫對(duì)鉻超富集植物李氏禾根系吸收銅的影響，從能量抑制和離子拮抗的角度探討了李氏禾根系吸收銅的機(jī)理，為揭示富集/超富集植物吸收銅的生物學(xué)機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1植物培養(yǎng)

水培試驗(yàn)的李氏禾采自未受重金屬污染的桂林市雁山鎮(zhèn)田邊。選取生長(zhǎng)一致的李氏禾幼苗，用

去離子水洗凈，放入含有1/2強(qiáng)度的改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的1.5 L塑料盆中，于人工氣候箱（LRH-550-GSI）中培養(yǎng)，控制植物生長(zhǎng)條件為：光照周期12 h，25 ℃白天/20 ℃晚上，相對(duì)濕度75%，光照強(qiáng)度7000 Lx。每天加1次超純水來保持培養(yǎng)液的體積，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)10 d后用于以下各種試驗(yàn)處理。

1.2離子通道抑制劑對(duì)Cu吸收的影響

實(shí)驗(yàn)前，將李氏禾幼苗轉(zhuǎn)移至pH為5.5的250 μmol·L-1CaCl2溶液中預(yù)培養(yǎng)。12 h后，對(duì)李氏禾幼苗進(jìn)行如下3組處理：（1）0.3 mmol·L-1CuSO4（對(duì)照）；（2）1 mmol·L-1鈣離子通道抑制劑（LaCl3）+0.3 mmol·L-1CuSO4；（3）5 mmol·L-1鉀離子通道抑制劑（TEA）+0.3 mmol·L-1CuSO4。所有處理的pH值均調(diào)至5.5左右，分別于處理后的1、2、4、8、12、24和48 h收獲植物，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3代謝抑制劑對(duì)Cu吸收的影響

實(shí)驗(yàn)前，將李氏禾幼苗轉(zhuǎn)移至pH為5.5的250 μmol·L-1CaCl2溶液中預(yù)培養(yǎng)。12 h后，對(duì)李氏禾幼苗進(jìn)行如下5組處理：（1）0.3 mmol·L-1CuSO4（對(duì)照）；（2）25 μmol·L-1ATP酶抑制劑（Na3VO4）+0.3 mmol·L-1CuSO4；（3）50 μmol·L-1Na3VO4+0.3 mmol·L-1CuSO4；（4）25 μmol·L-1解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚（DNP）+0.3 mmol·L-1CuSO4；（5）50 μmol·L-1DNP+0.3 mmol·L-1CuSO4。所有處理的pH值均調(diào)至5.5左右，分別于處理后的1、2、4、8、12、24和48 h收獲植物，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4低溫對(duì)Cu吸收的影響

實(shí)驗(yàn)前，將李氏禾幼苗轉(zhuǎn)移至pH為5.5的250 μmol·L-1CaCl2溶液中預(yù)培養(yǎng)。12 h后，加入含有0.3 mmol·L-1CuSO4的培養(yǎng)液，然后將處理后的植物立刻放進(jìn)2 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)，分別于處理后的1、2、4、8、12、24和48 h收獲植物，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，以1.2中的對(duì)照作為正常溫度（25 ℃）的對(duì)照。

1.5樣品分析方法

將植物的根放入含有10 mmol·L-1EDTA的超聲波中清洗3次，每次清洗10 min，去除吸附在植物根表面的金屬離子（LEITA等，1991）。清洗后的根用去離子水洗3次，再用吸水紙把表面的水吸干。將新鮮的樣品放入105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min，然后80 ℃烘干至恒重，再磨碎。

磨碎的樣品用濃HNO3和H2O2進(jìn)行消解，銅的含量用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定。

1.6數(shù)據(jù)處理

本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用三個(gè)平行樣測(cè)定值的算數(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件中的單因素方差（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（p＜0.05）。采用Origin 8進(jìn)行作圖。

圖1 鉀鈣離子通道抑制劑對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響Fig.1 Effects of TEA and LaCl3on Cu uptake by roots of L. hexandra

2 結(jié)果與分析

2.1離子通道抑制劑對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響

在離子通道抑制劑的作用下，李氏禾根吸收Cu（0.3 mmol·L-1）的動(dòng)態(tài)變化過程如圖1所示。在1 mmol·L-1鈣離子通道抑制劑（LaCl3）的作用下，李氏禾根對(duì)Cu的吸收明顯被抑制（p＜0.05，圖1）。處理48 h后，李氏禾根中Cu的濃度較對(duì)照下降了39.2%。表明李氏禾對(duì)Cu的吸收與鈣離子通道密切相關(guān)。然而，在5 mmol·L-1鉀離子通道抑制劑（TEA）的作用下，李氏禾根對(duì)Cu的吸收并沒有明顯被抑制，這說明李氏禾對(duì)Cu的吸收可能不通過鉀離子通道進(jìn)行。

2.2代謝抑制劑對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響

在ATP酶抑制劑（Na3VO4）的作用下，李氏禾根吸收Cu的動(dòng)態(tài)變化過程如圖2所示。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4均能顯著抑制李氏禾根對(duì)Cu的吸收（p＜0.05）。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4處理48 h后，李氏禾根中Cu的濃度較對(duì)照分別下降了26.2%和31.0%。在同一Cu濃度處理下，Na3VO4對(duì)李氏禾根吸收Cu的抑制作用并不隨Na3VO4濃度的增加而增加。這說明在48 h內(nèi)，25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4對(duì)李氏禾根吸收Cu的抑制作用沒有顯著差異（圖2）。

在解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚（DNP）的作用下，李氏禾根吸收Cu的動(dòng)態(tài)變化過程如圖3所示。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1DNP均能顯著抑制李氏禾根對(duì)Cu的吸收（p＜0.05）。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1DNP處理48 h后，李氏禾根中Cu的濃度較對(duì)照分

別下降了25.8%和42.7%。與Na3VO4作用下不同的是，在同一Cu濃度處理下，DNP對(duì)李氏禾根吸收Cu的抑制作用會(huì)隨著DNP濃度的增加而增加。在48 h內(nèi)，50 μmol·L-1DNP對(duì)李氏禾根吸收Cu的抑制作用顯著大于25 μmol·L-1DNP（p＜0.05）。但是在2h之前，DNP濃度對(duì)李氏禾根吸收Cu的抑制作用的影響并不明顯。可能的原因是DNP對(duì)李氏禾根的代謝抑制具有時(shí)間延遲。

圖2 Na3VO4對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響Fig.2 Effects of Na3VO4on Cu uptake by roots of L. hexandra

圖3 DNP對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響Fig.3 Effects of DNP on Cu uptake by roots of L. hexandra

圖4 低溫對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響Fig.4 Effects of low temperature on Cu uptake by roots of L. hexandra

2.3低溫對(duì)李氏禾根吸收Cu的影響

在2 ℃時(shí)，李氏禾根吸收Cu的動(dòng)態(tài)變化過程如圖4所示。2 h后，2 ℃處理后的李氏禾根對(duì)培養(yǎng)液中Cu的吸收均受到顯著地抑制。8 h時(shí)，2 ℃處理的李氏禾根中Cu的濃度較對(duì)照（25 ℃）下降了54.5%。在48 h時(shí)抑制作用最為明顯，李氏禾根中Cu的濃度較對(duì)照（25 ℃）下降了60.1%。這表明李氏禾根對(duì)Cu的吸收與植物的代謝水平有關(guān)。當(dāng)代謝水平下降時(shí)，李氏禾根對(duì)Cu的吸收明顯下降。

3 討論

離子通道是細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)孔道，通過通道門的快速啟閉來控制離子穿過等離子體膜的擴(kuò)散，是選擇性的離子過濾器（DUTERTRE和LEWIS，2010）。Ca2+和K+通道是兩個(gè)重要的陽離子通道，分別可通過LaCl3和TEA進(jìn)行抑制。LaCl3是一種非特異性的Ca2+通道抑制劑，能夠抑制質(zhì)膜上ATP酶的活性，并且阻礙細(xì)胞內(nèi)外離子交換（BONDGAARD和BJERREGAARD，2005）。本實(shí)驗(yàn)中，LaCl3顯著抑制了李氏禾根系對(duì)銅的吸收，而TEA對(duì)李氏禾根系吸收銅沒有抑制作用，這表明李氏禾根系吸收銅與Ca2+通道密切相關(guān)，但是可能不通過K+通道。施積炎（施積炎等，2004）等發(fā)現(xiàn)海州香薷根對(duì)銅的吸收與鈣離子通道密切相關(guān)，而鴨跖草根對(duì)銅的吸收則可能不通過鈣離子通道。由此可見，重金屬進(jìn)入植物體內(nèi)的離子通道的類型不僅與重金屬的種類有關(guān)，而且還與植物的種類有密切關(guān)系。

P型-ATP酶起著維持細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡的作用，是通用的離子泵。微量的釩酸鈉（Na3VO4，μmol級(jí)）即可抑制各種P型-ATP酶的活性（WILLIAMS等，2000）。Tabata（TABATA等，1997）等首次報(bào)道擬南芥中存在PAA1（一種P型-ATP酶），并參與轉(zhuǎn)運(yùn)Cu進(jìn)入葉綠體。Shikanai（SHIKANAI等，2003）等通過給Cu/Zn過氧化物歧化酶和內(nèi)囊體腔蛋白質(zhì)體藍(lán)素提供輔酶，證明HMA6（PAA1）負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)銅跨膜進(jìn)入葉綠體。Southron（SOUTHRON等，2004）等在歐洲油菜中發(fā)現(xiàn)了銅的轉(zhuǎn)運(yùn)體RAN1。Elizabeth（ELIZABETH和MARY，2006）等發(fā)現(xiàn)有三種P1B-ATP酶參與銅跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中。本實(shí)驗(yàn)中，在0.3 mmol·L-1Cu處理下，25 μmol·L-1和50 μmol·L-1Na3VO4均能顯著抑制李氏禾根對(duì)銅的吸收（圖2），這表明李氏禾內(nèi)存在轉(zhuǎn)運(yùn)銅的P型-ATP酶，銅的吸收與P型-ATP酶的活性有密切關(guān)系，即李氏禾根對(duì)銅可能存在主動(dòng)吸收的作用。

2,4-二硝基苯酚DNP是一種氧化磷酸化的化學(xué)解偶聯(lián)劑，由于它可以通過破壞線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度從而抑制ATP生成，而且解偶聯(lián)劑還可以引起線粒體中ATP的大量水解（FELLE和BENTRUP，1977；TRIPATHI等，1995）。由于大部分的生命活動(dòng)都需要耗能，因此線粒體內(nèi)的產(chǎn)能過程對(duì)生命體極為重要（SCHRAUWEN等，2006）。Sergi（SERGI和DENNIS，2002）等認(rèn)為Cu+是通過與兩種高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體Ctr1、Ctr2和一種低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體Fet4結(jié)合才從外界跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的。本實(shí)驗(yàn)中，25 μmol·L-1和50 μmol·L-1DNP均能顯著抑制李氏禾根對(duì)Cu的吸收（圖3），這表明解偶聯(lián)劑的使用減少了植物的能量供應(yīng)，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過構(gòu)象變化來跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子是一個(gè)需要能量的過程。進(jìn)一步說明李氏禾根吸收銅需要消耗能量，可能是一個(gè)主動(dòng)吸收的過程。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Na3VO4抑制吸收的結(jié)果一致。

為了排除代謝抑制劑本身對(duì)植物細(xì)胞通透性的破壞，從而對(duì)植物吸收銅造成影響，因此還分析了低溫（2 ℃）對(duì)李氏禾根吸收銅的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，48 h后，低溫對(duì)李氏禾根吸收銅的抑制作用最為顯著。因?yàn)榈蜏啬軌蛴绊懨傅幕钚詮亩种浦参锏目傮w代謝水平（RUELLAND和ZACHOWSKI，2010），因此同時(shí)抑制了Cu2+和Cu+的吸收。低溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果又進(jìn)一步證實(shí)李氏禾根對(duì)銅的吸收可能存在主動(dòng)吸收的機(jī)制。施積炎（施積炎等，2004）等研究也表明，海州香薷和鴨跖草對(duì)銅存在主動(dòng)吸收。本研究結(jié)果顯示，Na3VO4、DNP和低溫均能顯著抑制李氏禾根對(duì)銅的吸收，表明李氏禾根對(duì)銅的吸收是一個(gè)主動(dòng)吸收的過程。植物對(duì)金屬離子的主動(dòng)吸收機(jī)制有助于將土壤或水體中更多的重金屬離子轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，有利于利用植物修復(fù)技術(shù)修復(fù)被重金屬污染的環(huán)境。

4 結(jié)論

鈣離子通道抑制劑（LaCl3）顯著抑制了李氏禾根系對(duì)銅的吸收，而鉀離子通道抑制劑（TEA）對(duì)李氏禾根系吸收銅沒有抑制作用，這表明李氏禾根系吸收銅與鈣離子通道密切相關(guān)，可能不通過鉀離子通道進(jìn)行。

ATP酶抑制劑釩酸鈉（Na3VO4）、解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚（DNP）和低溫（2 ℃）處理均能顯著地抑制李氏禾根系對(duì)銅的吸收，這表明李氏禾根系吸收銅存在主動(dòng)吸收機(jī)制。

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Mechanisms of Cu Uptake in a Multi-metal Accumulating Plant Leersia hexandra Swartz

TIAN Jing, ZHANG Xuehong*, CHEN Jun, LIU Jie
College of Environmental Science and Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China

Leersia hexandra Swartz is a multi-metal accumulating plant. The study on the mechanisms of Cu uptake by roots of L. hexandra will help to understand how plants accumulate copper. Additionally, understanding Cu uptake mechanisms in plants is also valuable for phytoremediation of Cu-contaminated soil by L. hexandra. In the present work, a series of greenhouse hydroponic experiments were carried out to study the relationship of Cu2+uptake with Ca2+and K+channels using a calcium ion channel blocker (LaCl3) and a potassium ion channel blocker (TEA). Effects of ATPase inhibitor, uncoupler, and low temperature on Cu2+uptake by roots of L. hexandra were also studied, respectively. Based on these experiments, Cu uptake mechanisms in L. hexandra were discussed. The results showed that Ca2+channel blocker significantly limited the Cu uptake (p＜0.05). After 48 h treatment with 1 mmol·L-1LaCl3, Cu concentration in the roots was decreased by 39.2% as compared to the control group, which indicated that Cu uptake by roots of L. hexandra was closely related to Ca2+channel. Conversely, K+channel blocker did not inhibit Cu uptake, suggesting that Cu2+did not pass through potassium ion channels. ATPase inhibitor (Na3VO4) significantly limited the Cu uptake (p＜0.05). Cu concentrations in the roots exposed to 25 μmol·L-1and 50 μmol·L-1Na3VO4for 48 h were decreased by 26.2% and 31.0%, respectively. Therefore, the Cu uptake by the roots of L. hexandra may need energy consumption. This was supported by the observation that Cu uptake was significantly limited by an uncoupler, 2, 4-dinitrophenol (DNP). Cu concentrations in roots were decreased by 25.8% and 42.7% compared to control after 48 h exposure to 25 μmol·L-1and 50 μmol·L-1DNP. Effects of low temperature on Cu uptake were more pronounced than those of ATPase inhibitor and uncoupler. Cu concentration in roots was decreased by 60.1% at 2 ℃ for 48 h. The result confirmed that the Cu uptake by roots of L. hexandra was an active process dependent on energy consumption.

L. hexandra; Cu; uptake; inhibitors; active transport

X173

A

1674-5906（2014）07-1217-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41361085)；“八桂學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助；廣西危險(xiǎn)廢物處置產(chǎn)業(yè)化人才小高地基金

田靜（1988年生），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹亟饘傥廴炯盎謴?fù)生態(tài)學(xué)。E-mail: tianjing421@sina.com

*通訊作者：E-mail: zhangxuehong@x263.net

2014-03-03

田靜，張學(xué)洪，陳俊，劉杰. 多金屬富集植物李氏禾根系對(duì)銅吸收機(jī)理的研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2014, 23(7): 1217-1221.

TIAN Jing, ZHANG Xuehong, CHEN Jun, LIU Jie. Mechanisms of Cu Uptake in a Multi-metal Accumulating Plant Leersia hexandra Swartz [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(7): 1217-1221.