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（1.興化市陶莊獸醫(yī)站，江蘇興化 225733；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

對一株鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

徐榮妹1，劉金彪2

（1.興化市陶莊獸醫(yī)站，江蘇興化 225733；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

從江蘇興化地區(qū)某養(yǎng)鴨場的病鴨中采集樣本，經(jīng)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化檢測、凝集試驗(yàn)及PCR檢測，分離到一株厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，并被鑒定為11型鴨疫里默氏桿菌，定名為JY-58株。

鴨疫里默氏桿菌；分離；鑒定

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的，主要侵害雛鴨等多種禽類的急性或慢性接觸性傳染病，該病呈急性或慢性敗血癥，常見癥狀為精神沉郁、流眼淚和流鼻液、輕度咳嗽、排綠色稀糞、共濟(jì)失調(diào)、頭頸震顫和昏迷。其特征性病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎[1]。鴨疫里默氏桿菌是一種革蘭氏陰性、無鞭毛、無芽孢的棒狀桿菌，瑞氏染色呈兩極著色。本病最早在1932年發(fā)現(xiàn)于美國紐約州的長島，其后在英國、加拿大、前蘇聯(lián)、澳大利亞等國亦有發(fā)生。我國于1982年首次報(bào)道本病的存在，各地均有發(fā)生，該病的發(fā)病率與死亡率都很高，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。近年來，江蘇地區(qū)蛋鴨和肉鴨飼養(yǎng)發(fā)展迅速，一些養(yǎng)鴨場疑似鴨疫里默氏桿菌病時(shí)有發(fā)生，我們對江蘇興化某規(guī)?；B(yǎng)鴨場的病死鴨進(jìn)行了細(xì)菌分離，并鑒定為11型RA，定名為JY-58株，旨在為江蘇省防制本病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料。江蘇興化地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)鴨場發(fā)生較大規(guī)模傳染病。該養(yǎng)鴨場約有1萬只3周齡左右的雛鴨，發(fā)病100只，死亡28只，病鴨表現(xiàn)為倦怠、縮頸、不食或少食、眼鼻有分泌物、腹瀉、排淡綠色糞、行動遲緩、運(yùn)動失調(diào)。無菌采取該鴨場病鴨肝臟，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種。2型鴨疫里默氏桿菌（RA-2）取自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 試劑。LB培養(yǎng)基（OXOIDLTD，BASINGSTOKE，HAMPSHIRE，ENGLAND）；血清（海克隆生物化學(xué)制品有限公司）；微量發(fā)酵管（杭州天和微生物試劑有限公司）；Taq酶（晶美生物工程有限公司）；dNTP（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；瓊脂糖（基因技術(shù)（上海）有限公司）；EB（美國BBI公司）。

1.2 方法

1.2.1 RA的分離。無菌條件下，用接種棒挑取病鴨肝臟組織，涂在血清LB平板上，厭氧培養(yǎng)（厭氧罐，并放入37℃溫箱）；同時(shí)涂在麥康凱平板上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 染色鏡檢。將血清LB平板上培養(yǎng)所得菌株分別進(jìn)行瑞氏染色和革蘭氏染色，并置顯微鏡下觀察。

1.2.3 生化檢測。采用微量發(fā)酵管進(jìn)行葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、尿素酶、H2S和硝酸鹽還原試驗(yàn)；吲哚、M-R、V-P、過氧化氫酶試驗(yàn)等參照文獻(xiàn)[2-3]進(jìn)行；運(yùn)動力測定采用半固體穿刺法，同時(shí)設(shè)RA-2作陽性對照。

1.2.4 凝集試驗(yàn)。疑似菌株24h培養(yǎng)物按文獻(xiàn)介紹[4]的方法進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，試驗(yàn)用鴨疫里氏桿菌1型、2型、3型、11型陽性血清均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.5 PCR鑒定及產(chǎn)物純化。根據(jù)國外發(fā)表的RA序列[5]，用primer5.0設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用來擴(kuò)增大約546bps大小的基因片段。上游引物（P1）：5’–TTACCGACTGATTGCCTTCTAG 3；下游引物（P2）：5’–AGAGGAAGACCGAGGACATC 3；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

DNA的提?。罕緦?shí)驗(yàn)使用煮沸法提取DNA。①吸取分離株細(xì)菌液100μL，12000r/min離心5min；②去上清，加100μL超純水重懸，離心，12000r/min，5min，重復(fù)3次；③加封口膜煮沸10min，冰浴10min；④12000r/min離心5min，取上清，作為模板DNA。

PCR反應(yīng)體系：在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL 模板DNA，0.5μL TaqDNA，0.5μL上 游引物，0.5μL下游引物，17μL dH2O，0.5μL dNTP， 1.5μL Mg2+，總量25μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，以核苷酸分子量DNA Marker 200確定目的條帶的大小。

2 結(jié)果

2.1 染色鏡檢

分離菌株經(jīng)瑞氏染色，略呈兩極著色，為兩極濃染的小桿菌；革蘭氏染色呈陰性細(xì)小短桿菌，單個或成對分布。

2.2 生化檢測

分離株生化檢測結(jié)果顯示：RA-2和JY-58分離物均不能發(fā)酵糖（-），皆能液化明膠（+），且分離物對過氧化氫酶分解都表現(xiàn)為陽性，其余各項(xiàng)全為陰性，基本符合RA的特征（表1）。

表1 分離菌株的生化檢測結(jié)果

2.3 玻板凝集試驗(yàn)

該分離株與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行反應(yīng)，對11型陽性血清為明顯凝集，鑒定為鴨疫里默氏桿菌11型（表2）。

表2 分離株玻板凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR檢測結(jié)果

結(jié)果表明：RA-2株及JY-58菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，均出現(xiàn)600 bps左右大小的目的片段（圖1），與預(yù)期大小基本相符。因此基本確定其為鴨疫里默氏桿菌。

3 討論

圖1 PCR檢測結(jié)果

目前，鴨疫里氏桿菌感染呈全球性流行是造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最主要傳染病之一，其血清型呈多樣性，已經(jīng)報(bào)道的有21個血清型，不同的血清型間缺少交叉保護(hù)，加之用藥治療易產(chǎn)生耐藥性，這給我國RA病的防控帶來了很大困難。羊建中等在江蘇蘇中地區(qū)12家發(fā)病鴨場中分離到5種血清型的RA及未定型RA，證實(shí)該地區(qū)RA至少存在5種血清型，血清1、2、3型為主要血清型[4]。云水麗等在江蘇新沂地區(qū)的病鴨體內(nèi)分離到一株細(xì)菌，經(jīng)病原分離鑒定證實(shí)為血清11型RA[1]。本試驗(yàn)是從江蘇興化地區(qū)的病鴨體內(nèi)分離到一株細(xì)菌，鑒定為血清11型RA，與云水麗等報(bào)道的血清型一致，證明血清11型RA為目前該地區(qū)的主要血清型。如對該分離菌株進(jìn)行進(jìn)一步的生物學(xué)特性、毒力、最小致病力等方面的研究，研制針對該血清型的滅活疫苗對該病的預(yù)防控制具有重要意義[6]。

[1] 云水麗，楊勇，王小波，等.11型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（8）：605-609.

[2] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，2001：126-127.

[3] 董渝，李文楊，程龍飛，等.3株鴨疫里默氏菌血清型鑒定及其生化特性的比較[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29（1） ：87-89.

[4] 羊建平，王傳鋒.蘇中地區(qū)鴨疫里氏桿菌血清學(xué)調(diào)查及多價(jià)疫苗的研制[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（4）：40-42.

[5] CrastaK C，Michael TJ. Identifcation and characterization of CAMP cohemolysin as a potential virulence factor of Riemerella anatipestifer[J].Bacterito，2002，184（7）：1932-1939.

[6] 王曉麗，王永明，龍冬，等.一例鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009（4）：18.

Isolation and identifcation of a strain of Riemerella anatipestifer

Xu Rongmei1，Liu Jinbiao2
（1. Taozhuang Veterinary Station of Xinghua City，Jiangsu 225733；2. College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Samples were collected from ill ducks in a duck farm in Xinghua area，Jiangsu province，and a strain of anaerobic gram-negative bacterium was obtained through isolation and culture，staining，biochemical test，agglutination test and PCR test，which was identifed as serotype 11 Riemerella anatipestifer，named as JY-58 strain.

Riemerella anatipestifer；isolation；identifcation

S852.615；S858.32

：B

：1005-944X（2014）08-0077-03

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

劉金彪