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      基于蛋白質(zhì)組學(xué)的細(xì)胞色素P450和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶亞型絕對(duì)定量分析

      2014-02-27 21:16鄒漢法等
      分析化學(xué) 2014年1期

      鄒漢法等

      摘要:利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,將大鼠肝微粒體樣品進(jìn)行胰蛋白酶水解;再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS),采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),通過測(cè)定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段,實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對(duì)定量。本實(shí)驗(yàn)首先建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,對(duì)肝微粒體樣品中P450和UGT進(jìn)行定量,在線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r>0.995,線性關(guān)系良好,定量限≤10 nmol/L;以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo),對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明,同位素標(biāo)記特征肽段與未標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致,在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g,兩種方法所得結(jié)果基本一致,但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡(jiǎn)便,更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。

      關(guān)鍵詞:葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶; 多反應(yīng)監(jiān)測(cè); 肝微粒體; 細(xì)胞色素P450; 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

      1引言

      藥物進(jìn)入體內(nèi),可以通過代謝以一種或多種有活性的或無活性的代謝產(chǎn)物形式進(jìn)行清除。當(dāng)藥物主要以代謝方式清除時(shí),代謝途徑對(duì)藥物的安全性和療效有很大的影響[1,2]。在參與藥物代謝的各類酶中,細(xì)胞色素P450酶(簡(jiǎn)稱CYP或P450)和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)介導(dǎo)絕大部分的代謝反應(yīng)。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT家族中多種酶的定量,對(duì)研究藥物代謝具有重要意義,從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用(DDI)及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。在過去的研究中,常通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RTPCR)[3,4]、2維電泳法(2DPAGE)[5]\,免疫印跡法(Western blotting)[6,7]及探針底物法[8,9]對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于mRNA的翻譯過程受多種因素的影響,因此測(cè)得的mRNA的量不能準(zhǔn)確代表蛋白酶的水平; 又因?yàn)樗幬锎x酶具有高度的序列同源性,使得現(xiàn)有方法專屬性差,伴有一定的交叉反應(yīng),這些方法上的缺點(diǎn)都限制了對(duì)藥物代謝酶的研究。

      隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10~14] ,也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過分析藥物代謝酶的氨基酸序列,找出能代表各蛋白酶的特征肽段,利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法,同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT的直接定量分析;以合成的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo),對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)物進(jìn)行定量。以往的間接定量實(shí)驗(yàn)操作繁瑣,影響因素多,所得結(jié)果不能直觀反應(yīng)實(shí)際藥物代謝酶水平。本實(shí)驗(yàn)具有準(zhǔn)確性高,重現(xiàn)性好,定量限低,高通量等優(yōu)點(diǎn),可用于藥物代謝酶的相關(guān)研究。

      2實(shí)驗(yàn)部分

      2.1儀器與試劑

      3結(jié)果與討論

      3.1目標(biāo)肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

      通過對(duì)待測(cè)P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進(jìn)行分析和檢索,選擇理論上可代表各酶亞型的多個(gè)特征肽段; 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對(duì)肝微粒體酶解樣品進(jìn)行測(cè)定[15]。根據(jù)樣品實(shí)際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16],確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例,首先通過高分辨質(zhì)譜對(duì)肝微粒體樣品進(jìn)行一級(jí)掃描 (圖1A);然后對(duì)[M+2H]2+母離子(m/z 668.85)進(jìn)行二級(jí)掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[15](圖1B),從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

      由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17],為更好地利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)各酶亞型的特征肽段進(jìn)行定量分析,需合成相應(yīng)特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應(yīng)值較高的母離子,如圖1C,確定用于定量分析的母離子m/z 669.1;選擇合適的能量,將母離子打碎;選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的碎片離子,如圖1D,確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5; 通過MRM實(shí)現(xiàn)對(duì)特征肽段的定量分析。

      且可有效消除由基質(zhì)效應(yīng)所帶來的誤差。如圖3所示,在甲酸溶液(0.1%)中,相同濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段色譜保留行為一致,穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段峰面積比值為1∶1.03, 響應(yīng)值基本相同,因此可以利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖4可見,穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好,能作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

      3.4大鼠肝微粒體樣品的測(cè)定

      摘要:利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,將大鼠肝微粒體樣品進(jìn)行胰蛋白酶水解;再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS),采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),通過測(cè)定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段,實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對(duì)定量。本實(shí)驗(yàn)首先建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,對(duì)肝微粒體樣品中P450和UGT進(jìn)行定量,在線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r>0.995,線性關(guān)系良好,定量限≤10 nmol/L;以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo),對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明,同位素標(biāo)記特征肽段與未標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致,在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g,兩種方法所得結(jié)果基本一致,但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡(jiǎn)便,更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。

      關(guān)鍵詞:葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶; 多反應(yīng)監(jiān)測(cè); 肝微粒體; 細(xì)胞色素P450; 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

      1引言

      藥物進(jìn)入體內(nèi),可以通過代謝以一種或多種有活性的或無活性的代謝產(chǎn)物形式進(jìn)行清除。當(dāng)藥物主要以代謝方式清除時(shí),代謝途徑對(duì)藥物的安全性和療效有很大的影響[1,2]。在參與藥物代謝的各類酶中,細(xì)胞色素P450酶(簡(jiǎn)稱CYP或P450)和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)介導(dǎo)絕大部分的代謝反應(yīng)。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT家族中多種酶的定量,對(duì)研究藥物代謝具有重要意義,從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用(DDI)及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。在過去的研究中,常通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RTPCR)[3,4]、2維電泳法(2DPAGE)[5]\,免疫印跡法(Western blotting)[6,7]及探針底物法[8,9]對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于mRNA的翻譯過程受多種因素的影響,因此測(cè)得的mRNA的量不能準(zhǔn)確代表蛋白酶的水平; 又因?yàn)樗幬锎x酶具有高度的序列同源性,使得現(xiàn)有方法專屬性差,伴有一定的交叉反應(yīng),這些方法上的缺點(diǎn)都限制了對(duì)藥物代謝酶的研究。

      隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10~14] ,也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過分析藥物代謝酶的氨基酸序列,找出能代表各蛋白酶的特征肽段,利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法,同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT的直接定量分析;以合成的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo),對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)物進(jìn)行定量。以往的間接定量實(shí)驗(yàn)操作繁瑣,影響因素多,所得結(jié)果不能直觀反應(yīng)實(shí)際藥物代謝酶水平。本實(shí)驗(yàn)具有準(zhǔn)確性高,重現(xiàn)性好,定量限低,高通量等優(yōu)點(diǎn),可用于藥物代謝酶的相關(guān)研究。

      2實(shí)驗(yàn)部分

      2.1儀器與試劑

      3結(jié)果與討論

      3.1目標(biāo)肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

      通過對(duì)待測(cè)P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進(jìn)行分析和檢索,選擇理論上可代表各酶亞型的多個(gè)特征肽段; 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對(duì)肝微粒體酶解樣品進(jìn)行測(cè)定[15]。根據(jù)樣品實(shí)際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16],確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例,首先通過高分辨質(zhì)譜對(duì)肝微粒體樣品進(jìn)行一級(jí)掃描 (圖1A);然后對(duì)[M+2H]2+母離子(m/z 668.85)進(jìn)行二級(jí)掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[15](圖1B),從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

      由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17],為更好地利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)各酶亞型的特征肽段進(jìn)行定量分析,需合成相應(yīng)特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應(yīng)值較高的母離子,如圖1C,確定用于定量分析的母離子m/z 669.1;選擇合適的能量,將母離子打碎;選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的碎片離子,如圖1D,確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5; 通過MRM實(shí)現(xiàn)對(duì)特征肽段的定量分析。

      且可有效消除由基質(zhì)效應(yīng)所帶來的誤差。如圖3所示,在甲酸溶液(0.1%)中,相同濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段色譜保留行為一致,穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段峰面積比值為1∶1.03, 響應(yīng)值基本相同,因此可以利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖4可見,穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好,能作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

      3.4大鼠肝微粒體樣品的測(cè)定

      摘要:利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,將大鼠肝微粒體樣品進(jìn)行胰蛋白酶水解;再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS),采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),通過測(cè)定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段,實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對(duì)定量。本實(shí)驗(yàn)首先建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,對(duì)肝微粒體樣品中P450和UGT進(jìn)行定量,在線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r>0.995,線性關(guān)系良好,定量限≤10 nmol/L;以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo),對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明,同位素標(biāo)記特征肽段與未標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致,在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g,兩種方法所得結(jié)果基本一致,但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡(jiǎn)便,更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。

      關(guān)鍵詞:葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶; 多反應(yīng)監(jiān)測(cè); 肝微粒體; 細(xì)胞色素P450; 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

      1引言

      藥物進(jìn)入體內(nèi),可以通過代謝以一種或多種有活性的或無活性的代謝產(chǎn)物形式進(jìn)行清除。當(dāng)藥物主要以代謝方式清除時(shí),代謝途徑對(duì)藥物的安全性和療效有很大的影響[1,2]。在參與藥物代謝的各類酶中,細(xì)胞色素P450酶(簡(jiǎn)稱CYP或P450)和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)介導(dǎo)絕大部分的代謝反應(yīng)。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT家族中多種酶的定量,對(duì)研究藥物代謝具有重要意義,從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用(DDI)及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。在過去的研究中,常通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RTPCR)[3,4]、2維電泳法(2DPAGE)[5]\,免疫印跡法(Western blotting)[6,7]及探針底物法[8,9]對(duì)藥物代謝酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于mRNA的翻譯過程受多種因素的影響,因此測(cè)得的mRNA的量不能準(zhǔn)確代表蛋白酶的水平; 又因?yàn)樗幬锎x酶具有高度的序列同源性,使得現(xiàn)有方法專屬性差,伴有一定的交叉反應(yīng),這些方法上的缺點(diǎn)都限制了對(duì)藥物代謝酶的研究。

      隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10~14] ,也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過分析藥物代謝酶的氨基酸序列,找出能代表各蛋白酶的特征肽段,利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線法,同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)P450和UGT的直接定量分析;以合成的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo),對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)物進(jìn)行定量。以往的間接定量實(shí)驗(yàn)操作繁瑣,影響因素多,所得結(jié)果不能直觀反應(yīng)實(shí)際藥物代謝酶水平。本實(shí)驗(yàn)具有準(zhǔn)確性高,重現(xiàn)性好,定量限低,高通量等優(yōu)點(diǎn),可用于藥物代謝酶的相關(guān)研究。

      2實(shí)驗(yàn)部分

      2.1儀器與試劑

      3結(jié)果與討論

      3.1目標(biāo)肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

      通過對(duì)待測(cè)P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進(jìn)行分析和檢索,選擇理論上可代表各酶亞型的多個(gè)特征肽段; 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對(duì)肝微粒體酶解樣品進(jìn)行測(cè)定[15]。根據(jù)樣品實(shí)際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16],確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例,首先通過高分辨質(zhì)譜對(duì)肝微粒體樣品進(jìn)行一級(jí)掃描 (圖1A);然后對(duì)[M+2H]2+母離子(m/z 668.85)進(jìn)行二級(jí)掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[15](圖1B),從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

      由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17],為更好地利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)各酶亞型的特征肽段進(jìn)行定量分析,需合成相應(yīng)特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應(yīng)值較高的母離子,如圖1C,確定用于定量分析的母離子m/z 669.1;選擇合適的能量,將母離子打碎;選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的碎片離子,如圖1D,確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5; 通過MRM實(shí)現(xiàn)對(duì)特征肽段的定量分析。

      且可有效消除由基質(zhì)效應(yīng)所帶來的誤差。如圖3所示,在甲酸溶液(0.1%)中,相同濃度的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段色譜保留行為一致,穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段與非標(biāo)記特征肽段峰面積比值為1∶1.03, 響應(yīng)值基本相同,因此可以利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖4可見,穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好,能作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

      3.4大鼠肝微粒體樣品的測(cè)定

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