方征東 胡何節(jié) 董智慧 王曉天 孫小杰 葛新寶

小口徑聚乳酸-己內(nèi)酯/纖維蛋白原管形支架的構(gòu)建及生物相容性評價

方征東 胡何節(jié) 董智慧 王曉天 孫小杰 葛新寶

目的探索靜電紡絲技術(shù)制備小口徑聚乳酸-己內(nèi)酯[P(LLA-CL)]/纖維蛋白原管形支架的方法，評價支架的生物相容性，探討其作為血管組織工程材料的可行性。方法以P(LLA-CL)、纖維蛋白原為原料，制備小口徑復合管形支架，觀察支架的大體形態(tài)，并用掃描電鏡觀察三維結(jié)構(gòu)；利用溶血試驗、細胞毒性試驗、皮下植入試驗，評價支架材料的生物相容性。結(jié)果管形支架表面呈網(wǎng)格狀三維結(jié)構(gòu)，并有大小不等、互相交通的孔隙，孔徑平均直徑為（4.56±1.23）μm，表面纖維平均直徑（318±56）nm；P(LLA-CL)/纖維蛋白原浸提液溶血率為2.87%±0.49%；細胞毒性實驗示P(LLA-CL)/纖維蛋白原浸提液較陰性對照組無明顯差異（P＞0.05）；皮下植入試驗顯示P(LLA-CL)/纖維蛋白原支架炎癥反應輕微，材料逐漸降解。結(jié)論通過靜電紡絲技術(shù)可以構(gòu)建小口徑P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架，并具有良好的生物相容性，可作為組織工程血管的支架材料。

靜電紡絲管形支架聚左旋乳酸-己內(nèi)酯纖維蛋白原生物相容性

支架是血管組織工程研究的核心內(nèi)容之一，理想的組織工程血管應具有合適的生物力學性能和良好的生物相容性[1]。由于構(gòu)建的組織工程血管植入體內(nèi)后與血液接觸，因此用于構(gòu)建組織工程血管支架的材料要具有良好的生物相容性，其血液相容性及細胞毒性的優(yōu)劣直接影響了材料的臨床應用。

靜電紡絲技術(shù)是近年來發(fā)展的可以制備與天然

細胞外基質(zhì)類似結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的新技術(shù)，其制備的電紡纖維直徑在毫米至納米級別，并且具有高比表面積、高孔隙率、孔隙相連性好等特殊形貌[2-3]，這些特性對細胞黏附、生長、增殖有益[4]。與其他納米纖維制備方法相比，靜電紡絲技術(shù)能夠制備小直徑（＜6 mm）的管狀結(jié)構(gòu)[5]，并具有簡便快捷、成本低廉、結(jié)構(gòu)可控等優(yōu)點。這些特點使靜電紡絲技術(shù)在組織工程血管支架構(gòu)建領(lǐng)域具有突出優(yōu)勢。我們前期的研究表明，以聚乳酸-己內(nèi)酯[P(LLA-CL)]和纖維蛋白原為原料，通過靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的膜片具有高孔隙率的納米纖維結(jié)構(gòu)和良好的細胞親和力[6-7]。在本次試驗中，我們以P(LLA-CL)和纖維蛋白原為原料，利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建小口徑管形支架，并通過體內(nèi)、外實驗評價材料及浸提液的生物相容性，探討其作為血管組織工程材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

聚乳酸-己內(nèi)酯（濟南岱罡生物科技有限公司），纖維蛋白原（上海松力生物技術(shù)有限公司），六氟異丙醇（上海譽美化工有限公司），DMEM細胞培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國），MTT干粉（Sigma公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小口徑P(LLA-CL)/纖維蛋白管形支架制備

以六氟異丙醇為溶劑，配制8%（w/v）的PLCL溶液；以體積比9∶1混合六氟異丙醇與DMEM溶液，配制成混合溶劑，將纖維蛋白原溶于混合溶劑中配制成100 mg/mL的纖維蛋白原溶液；PLCL溶液與纖維蛋白原溶液以體積比2∶1混合后，置于磁力攪拌器上混勻2～3 h，直至溶液澄清，保存待紡。

取配制好的P(LLA-CL)/纖維蛋白原溶液10 mL置于靜電紡絲注射泵中，以直徑5 mm的不銹鋼金屬桿作為收集裝置。靜電紡絲機參數(shù)：電紡距離12 cm、靜電紡絲電壓15 KV、聚合物推進速度2 mL/h、接受裝置轉(zhuǎn)動速率500 r/min、注射器橫動速度10 cm/min。自金屬桿上取下管狀電紡支架，修剪兩端后置于干燥器內(nèi)干燥備用。

1.2.2 P(LLA-CL)/纖維蛋白原膜片三維結(jié)構(gòu)觀察

電紡支架固定在樣品臺上，噴金鍍膜后，Stereoscan 360掃描電鏡（Cambridge，UK）觀察支架的表面形貌。采用圖像分析軟件Image J測定電紡膜的纖維直徑和孔徑。

1.2.3 管形支架浸提液制備

將P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架裁剪為1 cm×1 cm×5 mm長條狀膜片，以環(huán)氧乙烷消毒后密封備用。以生理鹽水或含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按3 cm2/mL（表面積/體積）的浸提比例加入浸提液，置于37℃電熱恒溫水浴箱中浸提72 h。浸提液制備后24 h內(nèi)進行溶血試驗、細胞毒性試驗。

1.2.4 溶血試驗

健康家兔心臟采血10 mL，加入枸櫞酸鉀溶液制備成新鮮抗凝兔血。取2 mL抗凝兔血加入到98 mL生理鹽水中，配制成2%兔血混懸液。將P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架浸提液、氯化鈉注射液（陰性對照組）、蒸餾水（陽性對照組）2 mL加入到試管中，每組3管。上述試管置于37℃電熱恒溫水浴箱中保溫30 min后，每支試管加入2 mL新鮮配制的稀釋抗凝兔血，輕輕混勻，置37℃水浴箱中保溫60 min。離心后吸取上清液移入比色皿內(nèi)，用分光光度計在545 nm波長處測定吸光度（OD）值。按下方公式計算膜片的溶血率。若材料的溶血率小于5%，認為材料符合標準；溶血率大于5%則提示材料有溶血現(xiàn)象，不符合標準。

1.2.5 細胞毒性試驗

取對數(shù)期生長的L929細胞，按5×103個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)液，更換成含5%FBS的材料浸提液100 μL進行培養(yǎng)，并設(shè)空白對照組（含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基）、陰性對照組（高密度聚乙烯浸提液）和陽性對照組(體積分數(shù)為5%的DMSO溶液，每2天更換培養(yǎng)液。實驗時每組設(shè)3個復孔。在培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，分別于各組試驗孔中加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸出孔內(nèi)液體，每孔內(nèi)加入150 μL DMSO，置振蕩儀上振蕩10 min，選用波長490 nm的酶標儀測定OD值。按下式計算相對增殖率（RGR），進行毒性分級。

1.2.6 皮下植入實驗

將P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架材料剪為1.0 cm×1.0 cm的長條狀膜片。取體質(zhì)量為250±20 g的SD大鼠8只，雌雄不限，隨機分成4組，分別為2周、4周、8周、12周觀察組。SD大鼠背部脊柱兩側(cè)作0.5 cm切口，切開皮膚和淺筋膜，用鈍性解剖法在皮膚切口部位下制備一個皮下囊，每個囊內(nèi)植入一個膜片，膜片之間不能互相接觸，以3-0絲線縫

合切口。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，1周后拆線。植入后1 d、3 d和5 d觀察局部皮膚有無出血、紅腫和試樣排出等異?，F(xiàn)象，以及大鼠的飲食、精神等狀況。于每個觀察期末，無痛處死SD大鼠。解剖后肉眼觀察植入部位組織有無異常病變，并行HE染色，觀察材料局部炎癥反應情況。

1.2.7 統(tǒng)計學處理

所有計數(shù)資料以x±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 P(LLA-CL)/纖維蛋白原管型支架的三維結(jié)構(gòu)

P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架呈白色，質(zhì)地柔軟，彈性較好，受壓后易變形。制備的小口徑血管支架長度可根據(jù)需要修剪，一般為5～8 cm，內(nèi)徑5 mm左右，管壁厚度0.4～0.5 mm。

電鏡下，支架表面及兩端均可見光滑的納米纖維，纖維直徑為（318±56）nm，支架表面呈網(wǎng)格狀三維結(jié)構(gòu)，并有大小不等、互相交通的孔隙，孔徑平均為（4.56±1.23）μm（圖1）。

2.2 溶血試驗

根據(jù)公式計算，P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架浸提液溶血率為2.87%±0.49%，參照ISO10993標準及我國GB/Tl6886標準，材料溶血率低于5%為無溶血反應，可以認為此浸提液不引起溶血反應。

2.3 細胞毒性實驗

主要通過細胞增殖來評價材料的細胞毒性。細胞接種在材料上后，前3 d增殖不明顯，細胞數(shù)量沒有快速增加。接種3 d后，實驗組、陰性對照組及空白組細胞在纖維支架上開始生長，并在5 d后進人快速增長期，7 d后逐漸進入平臺期（圖2）。而陽性對照組沒有見到明顯的細胞生長。實驗組浸提液在1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的相對增殖率分別為81.96%、95.01%、83.33%、90.53%和92.43%，均＞80%，細胞毒性為0-1級，與陰性對照組無明顯差異（P＞0.05），表示其對細胞的生長無毒性作用。

2.4 皮下植入實驗

術(shù)后各實驗鼠均存活，飲食、飲水及活動情況較術(shù)前無明顯改變，皮膚切口愈合良好、未見膿性分泌物及異物排出。2周時，見植入的材料仍保持片狀形態(tài)；4周時，材料形態(tài)仍較完整，局部出現(xiàn)軟化現(xiàn)象；8周時，材料體積明顯縮小，結(jié)構(gòu)顯示不清，易破損；12周時，材料基本結(jié)構(gòu)破壞，肉眼未見明顯的材料剩余。HE染色顯示，2周時，材料結(jié)構(gòu)保持完好，外圍可見嗜中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞浸潤（圖3A）；4周時材料結(jié)構(gòu)仍清晰顯示，但結(jié)構(gòu)疏松，材料間隙部位可見浸潤細胞，以單核細胞為主，中性粒細胞較少見（圖3B）；8周時，材料結(jié)構(gòu)顯示不清，材料部位可見新生的組織纖維與材料混雜，并可見少量新生血管，炎癥反應明顯減退（圖3C）；12周時材料大部分已降解，降解區(qū)被成纖維細胞和新生膠原纖維代替，內(nèi)有較多的新生血管（圖3D）。

圖1P(LLA-CL)/纖維蛋白原支架（A：10×，B：2 000×，C：2 000×）Fig.1The SEM observation of the P(LLA-CL)/fibrinogen tubular scaffold(A:10×,B:2 000×,C:2 000×)

圖3 P(LLA-CL)/纖維蛋白原皮下植入試驗（HE染色，200×）Fig.3 Histological observation of the P(LLA-CL)/ fibrinogen tubular scaffold after subcutanous implantation by HE staining(200×)

3 討論

理想的組織工程支架應具有與天然細胞外基質(zhì)相類似的結(jié)構(gòu)，使用傳統(tǒng)的支架制備方法[8-9]（如溶劑澆鑄/粒子瀝出、氣體發(fā)泡、乳液冷凍干燥、熔融紡絲等）得到的纖維直徑一般為5～500 μm，明顯高于ECM的纖維直徑（其中膠原纖維直徑為50～500 nm），不利于種子細胞的黏附與增殖。本實驗中，我們使用的靜電紡絲技術(shù)[10]是通過在聚合物溶液上施加高壓電場來制備細小纖維，所構(gòu)建的支架纖維直徑為（318±56）nm，與ECM的纖維直徑類似。而且制備的這種納米無紡膜具有高比表面積、高孔隙率、孔隙相連性好等特殊形貌，有利于細胞的生長增殖。另外，通過調(diào)整靜電紡絲接受桿的直徑，我們可以制備各種不同直徑的小口徑支架，因而在組織工程血管支架的構(gòu)建中具有簡便快捷、成本低廉等優(yōu)點。

P(LLA-CL)是由左旋乳酸（L-LA）與ε-己內(nèi)酯（ε-CL）單體共聚的脂肪族聚酯，因其出色的柔韌性和彈性、良好的生物相容性，在血管組織工程中已備受關(guān)注[11]，但其缺乏良好的細胞相容性，不利于細胞生長[12]。纖維蛋白原是參與凝血過程后期的一個血漿糖蛋白，不僅參與凝血，且在創(chuàng)傷修復和腫瘤生長過程中也發(fā)揮了作用。上世紀80年代以來，以人血液或哺乳動物血液為原料制成的商品化纖維蛋白膠作為止血劑已廣泛應用于臨床[13]，已證明纖維蛋白具有良好的生物相容性。實驗研究也已證實，纖維蛋白基生物材料構(gòu)建的三維支架具有可降解性、無毒、無免疫原性[14]。我們前期的研究表明，將P(LLA-CL)與纖維蛋白原以合適的比例混合后，可以彌補各自的不足，具有良好的生物力學性能及細胞親和性[7]。本次試驗中，我們進一步對其生物相容性進行評價，探討此支架作為組織工程血管支架的可行性。

溶血實驗可以敏感地反映材料對紅細胞的影響，是一種特別有意義的材料篩選實驗。本實驗構(gòu)建的P(LLA-CL)/纖維蛋白原支架材料浸提液溶血率為2.87%±0.49%，小于5%，可以認為材料無溶血性，能滿足生物材料的醫(yī)用要求。但應注意的是，溶血試驗僅是與血液接觸材料的一個粗篩實驗，對于需要進入臨床應用的、與血液直接接觸的材料，還要詳細檢測材料對血液內(nèi)血小板、白細胞、血漿蛋白、補體系統(tǒng)等成分的作用。體外細胞毒性試驗是生物材料毒性評價中最基礎(chǔ)、最重要的評價標準，在1 d、3 d、5 d、7 d、9 d各時間點上，實驗組的毒性等級均為0或1級，即對細胞不產(chǎn)生明顯毒性，是安全的。皮下植入實驗中，管形支架膜片植入皮下后的2周內(nèi)，局部以急性炎癥反應為主，考慮與手術(shù)創(chuàng)傷有一定關(guān)系；4周后，材料周圍炎癥反應逐漸減輕，材料逐漸降解；至12周時，材料大部分已降解，材料降解區(qū)被成纖維細胞和宿主新生膠原纖維代替，表明P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架具有良好的組織相容性。

上述體內(nèi)、體外實驗結(jié)果證實，以靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的小口徑P(LLA-CL)/纖維蛋白原管形支架具有良好的體外/體內(nèi)生物相容性，符合生物材材料的醫(yī)用標準，有望進一步用于構(gòu)建組織工程血管。

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Establishment and Biocompatibility of a Small Diameter Tubular Scaffold of Electrospun Poly(L-lactide-co-ε- caprolactone)/fibrinogen Blended Fibers

ObjectiveTo fabricate a small diameter tubular scaffold of P(LLA-CL)/fibrinogen by electrospinning fiber technique,to evaluate the biocompatibility of the P(LLA-CL)/fibrinogen scaffold and its feasibility for vascular tissue engineering.MethodsA small diameter tubular scaffold was fabricated by co-electrospinning blend of P(LLA-CL)and Fibrinogen.Gross morphology of the scaffold was observed and the 3-dimensional structure was observed by scanning electron microscope(SEM).Biocompatibilities of the tubular scaffold were evaluated in vivo and in vitro by acute hemolysis test,cytotoxicity test,and short-term test of subcutanous implantation.ResultsA randomly oriented nanofibrous structure with a well interconnected network of pores was observed.The diameter of the fiber at the outer surface was 318±56 nm and the average pore diameter was 4.56±1.23 μm;Hemolysis rate was 2.87%±0.49%;There was no significant difference of cytotoxicity between the P(LLA-CL)/fibrinogen tubular scaffold and negative control group(P＞0.05).After the placement in rat subcutaneous pouches,the scaffolds were gradually biodegraded with little inflammatory reaction.ConclusionThe P (LLA-CL)/fibrinogen tubular scaffold can be fabricated by electrospinning fiber technique.It has good biocompatibility and could be potentially used as vascular tissue engineering scaffold material.

Electrospinning;Tubular scaffold;Poly(L-lactide-co-ε-caprolactone);Fibrinogen;Biocompatibility

Q813.1+3

A

1673－0364（2014）04－0207－04

FANG Zhengdong1,HU Hejie1,DONG Zhihui2,WANG Xiaotian1,SUN Xiaojie1, GE Xinbao1.
1 Department of Vascular Surgery,Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University,Hefei 230001, China;2 Department of Vascular Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China.Corresponding author:HU Hejie(E-mail:huhejie@hotmail.com).

安徽省自然科學基金（11040606M199，1208085MH151）。

230001安徽省合肥市安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院血管外科（方征東，胡何節(jié)，王曉天，孫小杰，葛新寶）；200032上海市復旦大學附屬中山醫(yī)院血管外科（董智慧）。

胡何節(jié)（E-mail：huhejie@hotmail.com）。

2013年12月19日；

2014年3月2日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.04.010