楊　延，劉迪秋，葛　鋒，陳朝銀（昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南昆明650500）

amiRNA技術(shù)及其在食用作物遺傳改良中的應用

楊延，劉迪秋，葛鋒*，陳朝銀
（昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南昆明650500）

內(nèi)源miRNAs（microRNAs）是負調(diào)控真核生物基因表達的關(guān)鍵因子。amiRNAs（artificial microRNAs）是模擬內(nèi)源miRNA的生成途徑人工合成的miRNA，它能高效抑制靶基因的表達。運用amiRNA技術(shù)調(diào)控基因表達在調(diào)控精確性、效率、遺傳穩(wěn)定性及生物安全性等多方面具有顯著優(yōu)勢。本文就amiRNA技術(shù)的原理、優(yōu)勢以及該技術(shù)在食用作物品質(zhì)改良及營養(yǎng)改善、雄性不育系培育、抗病毒和抗逆作物培育中的應用進行了綜述。

amiRNA，食用作物，基因沉默，遺傳改良，應用

miRNA是一類由內(nèi)源非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄加工形成的長約21nt的小分子RNA，主要通過與靶mRNA堿基互配指導靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控[1]。近年來，隨著對內(nèi)源miRNA的合成及沉默機制研究的不斷深入，催生了以amiRNA為基礎的基因沉默技術(shù)。amiRNA可模擬內(nèi)源miRNA的作用機制人為沉默目的基因，對比傳統(tǒng)的基因沉默技術(shù)，amiRNA在調(diào)控精確性、調(diào)控效率、遺傳穩(wěn)定性及生物安全性等多方面具有顯著優(yōu)勢。運用amiRNA技術(shù)調(diào)節(jié)食用作物中控制重要性狀基因的表達，可有效提高作物的營養(yǎng)價值，降低作物中有害成分的含量，或使作物獲得特有品質(zhì)性狀，因此在食用作物遺傳改良方面具有巨大應用潛力。本文主要對amiRNA技術(shù)及其在食用作物遺傳改良中的應用進行了較為全面的綜述。

1　amiRNA技術(shù)的原理

amiRNA技術(shù)是通過模擬內(nèi)源miRNA的生成及作用機制而人為地沉默目的基因。植物內(nèi)源miRNA的生成過程主要包括以下步驟：a.細胞核內(nèi)的miRNA基因首先由RNA聚合酶II作用轉(zhuǎn)錄形成具有莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的pri-miRNA[2]；b.pri-miRNA經(jīng)DCL1（Dicerlike1）酶剪切形成較短的pre-miRNA[3]；c.pre-miRNA再經(jīng)DCL1酶剪切形成長約21nt的雙鏈miRNA：miRNA*[4]；d.雙鏈的3’端在HEN1甲基轉(zhuǎn)移酶作用下發(fā)生甲基化[5]；e.經(jīng)甲基化修飾后的雙鏈被運送至細胞質(zhì)，最后經(jīng)解旋酶催化形成成熟單鏈miRNA，其互補鏈則通常被降解[6]。成熟的miRNA與AGO蛋白結(jié)合形成RISC（RNA-induced silencing complex），大部分的植物miRNA與靶mRNA以完全互補的方式結(jié)合，并誘導RISC對mRNA的特定位點進行切割使其降解，最終實現(xiàn)對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控[1]。amiRNA技術(shù)以內(nèi)源pre-miRNA為骨架，通過將pre-miRNA序列中的miRNA：miRNA*替換成人工設計的amiRNA：amiRNA*，形成pre-amiRNA，同時保持其莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)及能量特征基本不變，然后在生物體內(nèi)按照內(nèi)源miRNA的合成途徑形成人工miRNA[7-8]。

pre-amiRNA結(jié)構(gòu)可通過分別帶有amiRNA、miRNA前體環(huán)及amiRNA*序列的a、b、c片段經(jīng)重疊PCR延伸獲得。a、b、c片段可分別由A-IV、II-III、I-B3對引物擴增獲得（圖1）。擴增a、b、c片段的前3輪PCR及最后一輪重疊PCR所需的模板及引物參見表1。

圖1　重疊PCR法合成pre-amiRNA示意圖Fig.1　Construction of pre-amiRNA gene by overlapping PCR

表1　重疊PCR法合成pre-amiRNA所需引物及模板Table 1　The sequences of primers and templates used in overlapping PCR

2　amiRNA技術(shù)的優(yōu)勢

2.1簡便性

WMD3設計平臺為amiRNA技術(shù)帶來了極大便利，利用該平臺可實現(xiàn)植物amiRNA序列的自動化設計[9]。此外，WMD3設計平臺還提供了多個包含植物內(nèi)源miRNA前體序列的載體，如pRS300、pNW55、pChamiRNA1和pChamiRNA2[10-11]。根據(jù)最終選定的amiRNA，WMD3能自動設計出I-IV4條引物。amiRNA技術(shù)利用這4條及另外一對根據(jù)載體中內(nèi)源miRNA兩側(cè)的核苷酸序列而設計的A、B引物并以載體序列為模板，經(jīng)4輪PCR反應即可合成pre-amiRNA。之后經(jīng)一次酶切連接將pre-amiRNA組裝到合適的植物表達載體上即完成amiRNA干擾載體的構(gòu)建，減少了傳統(tǒng)RNAi載體構(gòu)建時目的基因序列的克隆及多次酶切連接步驟，縮短了實驗周期，提高了實驗的準確性。

然而多步PCR反應增加了堿基突變的概率，并且過程費力，不適用于批量操作。為了彌補此缺陷，Liang等[12]成功構(gòu)建了兩個人工miRNA載體：pAMIR395a和pAMIR319a，這兩個載體包含了內(nèi)源miRNA前體的5’和3’區(qū)域。研究者只需設計一對引物通過一次PCR反應就可獲得相應的amiRNA發(fā)夾區(qū)，然后經(jīng)酶切將其克隆到相應的表達載體上，最終產(chǎn)生所需amiRNA前體。Yan等[13]也構(gòu)建了一個植物通用amiRNA載體：pUAs，同樣也只需一對引物一次PCR反應就能獲得相應amiRNA。

2.2高特異性及高干擾效率

傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)往往會引起脫靶效應，造成精確性較差[14]，amiRNA技術(shù)彌補了傳統(tǒng)RNAi技術(shù)的這一缺陷。萊茵依藻（Chlamydomonas reinhardtii）中的HydA1和HydA2基因編碼序列同源性為69%，針對這兩個基因設計的amiRNA能精確識別并干擾各自的靶標[15]；BAHD1和BAHD2基因是水稻（Oryza sativa L.）中的兩個同源基因，針對BADH2基因構(gòu)建帶有Ubi組成型表達啟動子的amiRNA干擾載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)現(xiàn)T1代水稻胚乳中BADH2基因的表達量下降了約80%，而BADH1基因的表達量則無顯著變化[16]。這些研究表明，amiRNA的沉默效應具有較高特異性。amiRNA之所以具有較高的沉默特異性是因為amiRNA同內(nèi)源miRNA一樣與靶mRNA之間遵循嚴格堿基配對原則，錯配堿基數(shù)超過3個就無法識別，并且在amiRNA序列的2～12位不能存在錯配[17]，因此amiRNA對靶mRNA序列具有高度特異性，可實現(xiàn)對基因家族或等位基因中單個特異靶標的精確干擾。此外，在運用amiRNA技術(shù)時，可針對同一靶基因設計多條amiRNA，而每一條pre-amiRNA序列最終只能產(chǎn)生一個成熟amiRNA，因此無論發(fā)生靶基因沉默還是脫靶效應，都能確定是由該amiRNA引起的，在設計amiRNA序列時，選擇與靶mRNA序列特異性高的amiRNA序列，而避免選擇可能導致脫靶效應的序列，可大大減少實驗的盲目性，提高實驗的精確性。

amiRNA技術(shù)在干擾效率方面也比傳統(tǒng)RNAi技術(shù)具有優(yōu)勢。研究者針對擬南芥（Arabidopsis thaliana）的At2g19070基因分別構(gòu)建了RNAi和amiRNA干擾載體，轉(zhuǎn)化后獲得的RNAi轉(zhuǎn)化株中靶基因被強烈抑制的轉(zhuǎn)化子只占5%～10%，而所有amiRNA轉(zhuǎn)化株的靶基因抑制率都在90%以上[18-19]。另外，也有研究者分別構(gòu)建了hpRNA（hairpin RNA）和amiRNA干擾載體抑制水稻SBEIIb基因的表達，結(jié)果顯示ami-SBEIIb轉(zhuǎn)化株中SBEIIb基因的表達量較對照組下降了5倍，而hp-SBEIIb轉(zhuǎn)化株中靶基因表達量只下降了2倍[20]。這表明利用amiRNA技術(shù)只需要獲得少數(shù)轉(zhuǎn)化株就能有足夠多的高抑制株系，將該技術(shù)運用于實際生產(chǎn)可大大減少工作量，降低成本。

2.3靈活性

由于amiRNA靶向的序列長度僅為21nt，對于一個長度為幾百甚至上千堿基對的基因而言可提供的靶作用位點有很多，amiRNA技術(shù)可針對同一基因的不同靶位點設計多個amiRNA干擾載體，以此增強基因的沉默效率。amiRNA技術(shù)也可針對多個相關(guān)或不相關(guān)基因靈活構(gòu)建多個amiRNA串聯(lián)的表達載體，實現(xiàn)多基因同時沉默，在設計amiRNA序列時引入一定數(shù)量的錯配可同時干涉多個同源基因[12]。

通過體外構(gòu)建傳統(tǒng)RNAi表達載體而在植物體內(nèi)生成siRNA（small interference RNA）的策略，雖然可以有效沉默目的基因，但這些siRNA能通過植物大分子運輸系統(tǒng)擴散到其他組織，因此可能對正常植物組織和器官造成損傷。amiRNA技術(shù)可靈活選用誘導型或組織特異型啟動子，從而使amiRNA在特定時期表達或?qū)⑵涑聊窒抻谔囟ǖ慕M織中，最終實現(xiàn)對基因的表達進行時空調(diào)控。另外，通過更換強或弱啟動子則可以調(diào)控amiRNA對靶基因的抑制程度[8]。

2.4遺傳穩(wěn)定性

植物遺傳改良的基本要求之一就是后代必須具有良好的遺傳穩(wěn)定性。研究表明，多數(shù)轉(zhuǎn)入受體植物的amiRNA能在子代植株中穩(wěn)定遺傳并表達。Khraiwesh等[21]針對小立碗蘚（Physcomitrella patens）PpFtsZ2-1基因構(gòu)建了amiRNA干擾載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后在轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)現(xiàn)PpFtsZ2-1基因的表達量顯著降低，并表現(xiàn)出缺失突變體表型，繼續(xù)將這些轉(zhuǎn)基因植株繼代培養(yǎng)一年，結(jié)果顯示所有的植株仍保持缺失突變體表型。Vu等[22]利用amiRNA提高番茄（Solanum lycopersicumL.）對番茄曲葉病毒（ToLCV）的抗性，研究結(jié)果顯示80%的轉(zhuǎn)基因T2代對ToLCV具有抗性。Belide等[23]構(gòu)建了三個分別靶向擬南芥種子中FAD2、FAE1和FATB基因的amiRNA載體，結(jié)果顯示各轉(zhuǎn)化株均表現(xiàn)出靶基因缺失的突變體表型且該表型能穩(wěn)定遺傳超過三代。目前推測amiRNA之所以具有較強的遺傳穩(wěn)定性是因為它是利用植物體自身的miRNA加工體系獲得的，與內(nèi)源miRNA在結(jié)構(gòu)上具有高度相似性，因此能用接近于內(nèi)源miRNA抑制靶基因表達的機制來穩(wěn)定地沉默靶基因。amiRNA技術(shù)的這一顯著特征為該技術(shù)進一步運用于改良重要經(jīng)濟作物的遺傳性狀奠定了基礎。

2.5較高的生物安全性

與其他的基因沉默策略相比，amiRNA技術(shù)更具有生物安全性。普通基因沉默載體中外源插入片段的長度通常在幾百個堿基以上，較長的插入片段不僅增加了載體構(gòu)建的難度，同時插入片段容易與內(nèi)源基因及入侵植物體內(nèi)的病毒基因組發(fā)生同源重組，存在潛在的風險和威脅。amiRNA長度僅為21bp，與內(nèi)源基因及病毒基因組發(fā)生重組的風險很低，生物安全性較高[24]。

3　amiRNA技術(shù)在食用作物遺傳改良中的應用

3.1在食用作物品質(zhì)改良及營養(yǎng)改善中的應用

直鏈淀粉含量較高的淀粉具有凝固迅速、可降解等優(yōu)點，被廣泛應用于飲料的快速凝固劑，生產(chǎn)可降解快餐盒等食品工業(yè)中，此外，直鏈淀粉還具有降低膽固醇及預防膽結(jié)石形成的功效[25]。然而普通水稻中直鏈淀粉含量較低，秈稻中的含量一般為20%～ 30%，粳稻中為15%～22%。水稻中直鏈淀粉的含量主要受SBEI、SBEIIa和SBEIIb三種淀粉分支酶的影響，其中SBEIIb的影響最顯著[26]。研究表明amiRNA干擾載體能有效地抑制SBEIIb基因的表達（下降5倍），進而提高直鏈淀粉的含量（41.2%）[20]。

菜籽油是世界第三大食用油，油菜（Brassica campestrisL.）品質(zhì)改良的重要內(nèi)容是提高油酸以及降低芥酸含量。研究表明，與油菜同屬十字花科蕓苔屬的擬南芥，其基因組與油菜基因組具有高度同源性，從比較基因組學出發(fā)，來源于擬南芥的基因一般可以直接用于油菜中。如針對擬南芥中合成油酸和芥酸的基因（FAD2和FAE1）分別構(gòu)造amiRNA干擾載體后轉(zhuǎn)化到油菜中，結(jié)果顯示油菜中油酸的平均含量從15%提升到了63.3%，二十碳烯酸的含量從15.4%下降至1.9%[23]。這一結(jié)果為培育高油酸低芥酸油菜品種提供了重要參考。

棉花（Gossypium hirsutumL.）種子中的FAD2-1是催化油酸脫氫形成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，Zhao等[27]成功構(gòu)建了FAD2-1基因的amiRNA干擾載體，為培育油酸含量高的棉花品種奠定了基礎。

乳糜瀉是指由于人體對麩質(zhì)不耐受而引起的一種吸收不良綜合癥，屬于人體的一種自身免疫反應。引起乳糜瀉的主要抗原是小麥（Triticum aestivumL.）胚乳中的低分子量麥谷蛋白。在小麥胚乳的發(fā)育期，5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶（DEMETER）對低分子量麥谷蛋白編碼基因進行去甲基化作用，使其被激活并轉(zhuǎn)錄形成低分子量麥谷蛋白。由此構(gòu)建一個由胚乳特異啟動子啟動的amiRNA干擾載體來抑制DEMETER基因的表達能阻斷低分子量麥谷蛋白的合成，改良小麥的蛋白質(zhì)組分[24]。

稻米的香氣主要受Badh2基因控制，該基因通過編碼蛋白酶來抑制稻米香氣的主要成分2-乙酰-1-吡咯啉（2-acely-1-pyrrolin，2AP）的合成，以此調(diào)控稻米香味[28]。研究者針對Badh2基因構(gòu)建了兩個分別帶有Ubi組成型表達啟動子和GluC胚乳特異型表達啟動子的amiRNA干擾載體，轉(zhuǎn)化明恢86和日本晴兩種非香稻品種，經(jīng)鑒定確認T1代GluC∶BADH2amiRNA轉(zhuǎn)化株中BADH2基因的表達量并無顯著下降，同時檢測不到2AP，可能的原因是GluC啟動子的啟動活性較低，導致amiRNA的轉(zhuǎn)錄水平不足。相反，T1代Ubi∶BADH2amiRNA轉(zhuǎn)化株中BADH2基因的表達量較對照組下降了約80%，2AP含量顯著上升，獲得了具有更多香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因香稻[16]。

3.2在雄性不育系培育中的應用

雄性不育系的培育是雜交育種的前提，可利用amiRNA技術(shù)控制作物花粉發(fā)育，該方法的優(yōu)勢在于不僅能培育出具有遺傳穩(wěn)定性的雄性不育系，而且還能解決轉(zhuǎn)基因作物在生長過程中因傳粉而引起的基因漂移問題，同時縮短了育種時間。Toppino等[29]研究表明含有由花藥特異啟動子PTA29和PNTM1驅(qū)動的amiRNA干擾載體的茄子（Solanum melongenaL.）經(jīng)自然授粉后其結(jié)實率都明顯低于野生株。此外，T1代雄性不育性較強的轉(zhuǎn)化株花藥中TAF基因的表達量均低于野生株，說明此不育性能被穩(wěn)定遺傳，而獲得的雄性不育茄子經(jīng)乙醇處理后其不育性可恢復。

目前生產(chǎn)上使用的水稻雄性不育系普遍存在包穗現(xiàn)象，制約了水稻雜交制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，當前解決這一問題的辦法主要是噴灑赤霉素，不僅增加了制種生產(chǎn)成本，降低了種子質(zhì)量，還造成環(huán)境污染。eui1基因是一個控制稻穗節(jié)間伸長的隱性基因，利用amiRNA技術(shù)，將amiRNA-eui1表達載體轉(zhuǎn)化到ZS97B系中，再將其T1代與ZS97A系雜交，使amiRNA-eui1引入ZS97A系，結(jié)果表明成功轉(zhuǎn)入amiRNA-eui1的teZS97A轉(zhuǎn)基因系其稻穗節(jié)間伸長量明顯高于對照組，解除了不育系包穗現(xiàn)象[30]。

3.3在抗病毒育種中的應用

目前，amiRNA技術(shù)已被成功應用于小麥、馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）、葡萄（Vitis L.）、番茄、水稻等多種食用作物的抗病毒品種培育研究中（見表2）。

表2　amiRNA介導的沉默策略在食用作物抗病性研究中的應用Table 2　Applications using silencing strategy mediated by amiRNA in virus defense studies of alimentary crops

amiRNA載體可模擬內(nèi)源miRNA表達簇結(jié)構(gòu)，針對同一病毒基因的不同區(qū)段設計多個amiRNA并使之串聯(lián)表達，能有效增強轉(zhuǎn)amiRNA作物對靶病毒的抗性[31]。在實際生產(chǎn)中，作物常常遭遇多種病毒聯(lián)合侵染，并且病毒株系多，變異快，傳統(tǒng)的RNAi干擾技術(shù)只能使作物抵抗部分病毒株系，無法培育獲得具有持久廣譜病毒抗性的作物。amiRNA與靶mRNA之間允許存在一定數(shù)量的錯配堿基，針對病毒基因組保守區(qū)設計amiRNA，能使轉(zhuǎn)基因作物有效抵抗大多數(shù)病毒株系，并且即使病毒基因發(fā)生了突變也依然保持對該病毒的抗性，這既延長了作物的壽命，同時還能有效防止因病毒變異的積累而產(chǎn)生的新病毒株[34]。此外，有報道顯示，siRNA介導的抗病毒策略不適用于低溫作物，在低溫條件下，siRNA介導的病毒抗性將會被打破，而amiRNA策略即使在低溫條件仍能使作物保持對病毒具有高效抗性[36]。

3.4在抗逆食用作物培育中的應用

逆境脅迫嚴重威脅著世界范圍內(nèi)的作物產(chǎn)量提升，研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA在作物應對逆境脅迫應答過程中發(fā)揮了重要作用。在逆境脅迫條件下，這些miRNA能夠快速表達并作用于與逆境脅迫應答相關(guān)的基因，隨后啟動作物的抗逆信號系統(tǒng)，提高作物對不良環(huán)境的抵抗能力[37-39]。通過構(gòu)建miRNA表達載體，并在作物中表達參與抗逆脅迫應答相關(guān)的miRNA，是增強作物對逆境脅迫抗性的有效途徑[40-42]。構(gòu)建普通miRNA表達載體時通常需克隆pri-miRNA編碼基因，但一些pri-miRNA編碼基因含有限制性內(nèi)切酶位點或無法確定其準確的染色體定位而影響miRNA表達載體的構(gòu)建，amiRNA技術(shù)避開了pri-miRNA前體編碼基因的直接克隆步驟，彌補了普通miRNA表達載體構(gòu)建存在的缺陷[43]。ABA（Abscisic acid）可促進作物葉片氣孔關(guān)閉，從而降低水分蒸騰量，因此對作物起抗旱作用。CBP80（Cap-binding protein）會干擾ABA信號轉(zhuǎn)導過程，使作物對干旱脅迫耐性較差。Pieczynski等[44]針對CBP80基因構(gòu)建了CBP80-amiRNA表達載體，結(jié)果顯示，表達了CBP80-amiRNA的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對干旱具有較強的抗性。這表明運用amiRNA技術(shù)培育抗逆轉(zhuǎn)基因食用作物的策略是切實可行的。

4　展望

近年來雖然有研究證明amiRNA能有效抑制植物基因的表達，但該技術(shù)在實際應用中也存在一些問題。例如，影響amiRNA沉默效率的因素除了amiRNA序列之外，還受內(nèi)源miRNA前體骨架序列及其他小分子協(xié)同作用的影響；對內(nèi)源miRNA前體加工為成熟miRNA這一過程缺乏具體認識，這些因素使得amiRNA的沉默效果暫時還無法實現(xiàn)完全地人為控制。但amiRNA技術(shù)有其特有的優(yōu)勢：amiRNA技術(shù)避免了傳統(tǒng)RNAi技術(shù)的脫靶及非特異性效應等問題，同時該技術(shù)還具有方便、快捷、高通量篩查基因等優(yōu)點，它的應用必將加快小麥、玉米等重要多倍體食用作物的基因，特別是控制食用作物重要經(jīng)濟性狀的基因的功能研究進程；此外，amiRNA技術(shù)在改變代謝途徑中的某一特定階段及抵抗多種病毒入侵方面也十分有效[45]。我們課題組前期已經(jīng)完成了三七皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因-CAS基因的RNAi干擾，成功弱化了植物甾醇合成的副產(chǎn)物支流，但基因沉默的效率還有待提高，目前正在從事amiRNA技術(shù)在三七這一藥、食兩用作物的皂苷合成代謝調(diào)控研究。

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amiRNA technology and its applications in alimentary crop genetic improvement

YANG Yan，LIU Di-qiu，GE Feng*，CHEN Chao-yin
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

Endogenous miRNAs（microRNAs）are key factors which negatively regulate gene expression in eukaryotes.amiRNAs（artificial miRNAs）are the artificial miRNAs which are synthesized by simulating the synthesis pathway of endogenous miRNAs.amiRNAs can effectively inhibit the expression of target genes. Application of amiRNA technology in the regulation of gene expression has significant advantages in accuracy，efficiency，genetic stability and biology security.In this review，the principle and advantages of amiRNA technique，and the applications in alimentary crop quality improvement，nutrition improvement，male sterile lines breeding，anti-viral and anti-adversity crop breeding were summarized.

amiRNA；alimentary crop；gene silencing；genetic improvement；application

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0388-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.076

2013－12－03*通訊聯(lián)系人

楊延（1989-），女，碩士研究生，研究方向：藥用植物生物技術(shù)。

國家自然科學基金資助（31060044，31260070）。